Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em> Tribolium castaneum</em> Os embriões

A farinha besouro Tribolium castaneum vermelho, que pertence à grande família de escaravelhos pretos (Tenebrionidae), tem uma longa história no âmbito das ciências agrícolas e de vida e é o segundo mais bem estudada organismo modelo inseto modelo após a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Durante as últimas quatro décadas, tornou-se um poderoso e popular organismo inseto modelo em genética do desenvolvimento, em biologia evolutiva do desenvolvimento e, durante os últimos vinte anos, na morfogênese embrionária para uma variedade de razões:

Drosophila e Tribolium ambos pertencem ao Holometabola, mas divergiram aproximadamente 300 milhões de anos atrás, ^{1, 2, 3, 4.} Embora o desenvolvimento embrionário de Drosophila é vulgarmente considerado como altamente derivados, Tribolium mostra um modo mais ancestral da mentomento que é encontrado numa proporção consideravelmente maior de espécies de insectos ^{5, 6, 7, 8, 9.} Em primeiro lugar, Tribolium exibe desenvolvimento cabeça não-involuído, ou seja, as suas partes bucais e antenas já surgem durante a embriogénese ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Em segundo lugar, Tribolium segue os princípios do desenvolvimento de curto germe, ou seja, segmentos abdominais são adicionados sequencialmente a partir de uma zona de crescimento posterior durante o alongamento germband ^{16, 17, 18, 19.} Em terceiro lugar, Tribolium desenvolve e degrada posterioresduas membranas extra-embrionárias ou seja, o âmnio, o qual abrange o embrião única ventralmente, e a serosa, o qual envolve completamente o embrião ^{20, 21, 22.} Ambas as membranas desempenham um morfogenética cruciais ^23, bem como papel de proteção contra microorganismos ^{24, 25} e dessecação ^26. Em quarto lugar, as pernas embrionariamente em desenvolvimento são totalmente funcionais durante a fase de vida das larvas e servir como o primórdio para as pernas adulto durante a metamorfose de pupa ^{27, 28, 29, 30, 31.}

Devido ao seu tamanho e modestos pequenas demandas, cultivo de Tribolium em laboratório é bastante simples. As culturas de tipo selvagem (WT) estirpes ou linhas transgénicas consistem tipicamente de cerca de 100-300 adultos e pode ser mantido dentro de garrafas de um litro de vidro (80 cm pegada ²⁾ cheios de três a quatro centímetros de altura (cerca de 50 g) com meio de crescimento que é constituída por grãos de trigo completo farinha suplementado com levedura seca inactivo. Um fornecimento de água não é necessária. Isto permite que mesmo pequenos laboratórios para manter dezenas de culturas besouro dentro de pequenas ou médias incubadoras de insecto comercialmente disponíveis. Fases posteriores de desenvolvimento de Tribolium (larvas após aproximadamente o quarto instar, pupas e adultos) são facilmente separados a partir do meio de crescimento por peneiração. embriões sincronizados são obtidos por incubação de adultos para curtos períodos em forma de postura de ovos. Para o desenvolvimento rápido, culturas besouro são mantidos a 32 ° C (cerca de quatro semanas por geração), mantendo estoque é tipicamente realizada a 22-25 ° C (cerca de 10 semanas por geração).

Na última década, muitos tec padrãohniques foram gradualmente adaptada e optimizado para Tribolium, como resumido nos livros Emerging modelo Organismos ^32. De grande importância são avançados métodos genéticos, tais como embrionário ^33, larval ^{34, 35} ou parental ^{36, 37} de ARN baseada em interferência silenciamento de genes, transformação da linha germinativa com quer o piggyBac ^{38, 39} ou o sistema de transposase Minos ⁴⁰ e CRISPR / genoma baseados em cas9 engenharia ^41. Além disso, o genoma Tribolium foi sequenciado cerca de uma década atrás ^42, e está agora na terceira ronda de genoma conjunto de libertação ^43, o qual permite a identificação eficiente e de todo o genoma e a análise sistemática de genes ⁴⁴ </saté> ou outros elementos genéticos ^{45, 46.} Além disso, os genomas de outros quatro espécies de coleópteros está disponível para abordagens genéticas comparativos ^{47, 48, 49, 50.} Em associação com o genoma sequenciado, duas análises genéticas em larga escala têm sido efectuada, isto é um ecrã de mutagénese de inserção ⁵¹ e um gene knockdown tela à base de interferência de ARN sistemática ^{52, 53.}

Fluorescência de imagens ao vivo com widefield, confocal ou microscopia de luz com base em folha (LSFM) permite observar a morfologia embrionária de Tribolium como uma função do tempo (isto é, a morfogénese) num contexto de multi-dimensional (Tabela 1). Na microscopia de campo amplo e fluorescência confocal, o excitção e emissão de luz é guiado através da mesma lente objetiva. Em ambas as abordagens, toda a amostra é iluminada por cada plano bidimensional gravado. Assim, as amostras são sujeitas a níveis muito altos de energia. Em LSFM, apenas os fluoroforos no plano focal está animado devido a uma dissociação de iluminação e detecção por meio de duas lentes objectivas dispostas perpendicularmente (Figura 1). LSFM vem em duas implementações canónicos – o único plano iluminação microscópio (SPIM) e a luz do laser digitalizada à base de folha de microscópio de fluorescência digitais (DSLM, Figura 2) – e oferece várias vantagens importantes em relação às abordagens tradicionais: (i) capacidade de corte óptico intrínseca, (ii) resolução boa axial, (iii) fortemente reduzido nível de foto-branqueamento, (iv) muito baixo foto-toxicidade, (v) relação elevada sinal-para-ruído, (vi) relativamente elevada velocidade de aquisição, (vii) imagiologia ao longo de várias direcções e (viii) penetração mais profunda do tecido devido ao uso de baixo numérica abertura iluminação lentes objectivas ^{54, 55, 56.}

LSFM já foi aplicada com êxito em Tribolium para documentar quase toda a morfogénese embrionária ⁵⁷ e para analisar os princípios da ruptura da membrana extra-embrionária, no início do fecho dorsal ^23. Para aumentar a atratividade de LSFM na comunidade Tribolium e para a ciência de insetos em geral, é de grande importância para estabelecer procedimentos operacionais padrão e melhorar os métodos, protocolos e o conjunto de recursos para um nível onde o microscópio torna-se uma facilidade de -Use ferramenta padrão em laboratórios de biologia do desenvolvimento, e as questões biológicas ficar no centro das atenções.

Este protocolo começa com as noções básicas de Tribolium </ em> cultivo, ou seja, manutenção, reprodução e colheita de embriões. Em seguida, duas estratégias experimentais encontram-se ilustrados: (i) imagens ao vivo de linhas transgénicas feitos por medida e (ii) imagiologia de embriões fixos que foram coradas com corantes fluorescentes (Tabela 2). Subsequentemente, três técnicas de montagem com fins ligeiramente diferentes são explicados em detalhe (Figura 3 e Tabela 3): (i) a coluna de agarose, (ii) o hemisfério de agarose e (iii) o titular da teia romance. O protocolo, em seguida, explica o procedimento de aquisição de dados com LSFM. modalidades de imagem e considerações importantes são delineadas. Finalmente, a recuperação embrião é explicado e sugestões para processamento de dados básicos são fornecidos. Nos resultados representativos, os dados de imagem ao vivo de dois novos feito por encomenda e as ⁵⁸ linhas transgénicas glia-azul são mostrados e os respectivos conjuntos de dados de imagem são fornecidos como um recurso para download. Além disso, a imagemdados de embriões fixos que foram coradas com uma variedade de corantes de fluorescência são apresentados. A discussão centra-se em controle de qualidade, as actuais limitações da abordagem imagens ao vivo e a adaptação do protocolo para outras espécies.

O protocolo é escrito para microscópios de fluorescência baseado em folha de luz, que estão equipados com uma câmara de amostras e um mecanismo de fixação pode rodar para suportes normalizados de amostra ^{54, 59, 60,} que são tipicamente elementos em forma de cilindros feitos de metal, de plástico ou de vidro com um diâmetro na gama de milímetros. O protocolo também é adequado para ambas as implementações canónicos, ou seja SPIM e DSLM, bem como para as configurações com duas ou mais de iluminação e de detecção de braços ^{61, 62, 63.} Os resultados representativos mostram dados em dois canais espectrais, verde (ILluminação com um laser de 488 nm, detecção por meio de um filtro passa banda 525/50) e vermelho (iluminação com um laser de 561 nm, detecção por meio de um filtro passa banda 607/70), mas o protocolo pode ser expandido para três ou quatro canais espectrais.