Et grundlæggende mål for strukturelle biologistudier er at ophæve forholdet mellem biomolekylære maskineres struktur og funktion. Det første visuelle indtryk af biomolekyler ( fx proteiner og nukleinsyrer) forekom i 1950'erne gennem udvikling af røntgenkrystallografi ^{1 , 2} . Røntgenkrystallografi giver høj opløsning, statisk strukturel information, der er begrænset af krystalpakningen. Derfor skinner den iboende immobilitet af røntgenstrukturelle modeller biomolekylernes dynamiske natur, en faktor der påvirker de fleste biologiske funktioner ^{3 , 4 , 5} . Kernemagnetisk resonans (NMR) ^{6 , 7 , 8} tilvejebragte en alternativ løsning på problemet ved at løse strukturelle modeller i vandige opløsninger. En stor fordelAf NMR er dets evne til at genvinde den indre dynamiske natur af biomolekyler og konformationelle ensembler, hvilket hjælper med at afklare de indbyrdes forhold mellem struktur, dynamik og funktion ^{3 , 4 , 5} . Ikke desto mindre kræver NMR, begrænset af prøvestørrelse og store mængder af prøve, komplekse mærkningsstrategier for større systemer. Derfor er der et presserende behov for at udvikle alternative metoder inden for strukturbiologi.

Historisk har Forster-resonansenergioverførsel (FRET) ⁹ ikke taget en vigtig rolle i strukturbiologi på grund af den misforståelse, at FRET giver målinger med lav nøjagtighed. Formålet med denne protokol er at revidere FRETs evne til at bestemme afstande på nanometer skalaen, således at disse afstande kan anvendes til opbygning af strukturelle modeller af biomolekyler. Den første eksperimentelle verifikationAtion af R ^{– 6} afhængigheden af ​​FRET effektiviteten blev udført af Stryer i 1967 ¹⁰ ved måling af polyproliner af forskellige længder som en "spektroskopisk lineal". Et lignende eksperiment blev udført på enkeltmolekyleniveau i 2005 ¹¹ . Polyprolinmolekyler viste sig at være ikke-ideelle, og således blev dobbeltstrengede DNA-molekyler senere anvendt ¹² . Dette åbnede vinduet for præcise afstandsmålinger og ideen om at bruge FRET til at identificere strukturelle egenskaber hos biomolekyler.

FRET er optimal, når interdyeafstanden er fra ~ 0,6-1,3 R ₀ , hvor R ₀ er Förster-afstanden. For typiske fluoroforer, der anvendes i single-molekyle FRET-eksperimenter, er R0 ~ 50 Å. FRET tilbyder typisk mange fordele i forhold til andre metoder i sin evne til at løse og differentiere strukturer og dynamik iHeterogene systemer: (i) På grund af den ultimative følsomhed af fluorescens kan enkeltmolekylære FRET-eksperimenter ^{13 , 14 , 15 , 16} løse heterogene ensembler ved direkte at tælle og samtidigt karakterisere strukturerne af dets individuelle medlemmer. (Ii) Komplekse reaktionsveje kan direkte dechifteres i single-molecule FRET-undersøgelser, fordi der ikke er brug for nogen synkronisering af et ensemble. (Iii) FRET kan få adgang til en bred vifte af tidsmæssige domæner, der spænder over 10 årtier og dækker et bredt udvalg af biologisk relevante dynamikker. (Iv) FRET-eksperimenter kan udføres under eventuelle opløsningsbetingelser in vitro såvel som in vivo . Kombinationen af ​​FRET med fluorescensmikroskopi muliggør undersøgelsen af ​​molekylære strukturer og interaktioner direkte i levende celler ^{15 , 16 ,} </ Sup> ^{17 , 18 , 19} , selv med høj præcision ²⁰ . (V) FRET kan påføres systemer med næsten enhver størrelse ( fx polyprolin oligomerer ^{21 , 22 , 23 , 24} , Hsp90 ²⁵ , HIV revers transkriptase ²⁶ og ribosomer ²⁷ ). (Vi) Endelig kan et netværk af afstande, der indeholder alle dimensioner af biomolekyler, anvendes til at udlede strukturelle modeller af statiske eller dynamiske molekyler ^{18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,}Ref "> 35 ^{, 36 , 37} .

Derfor kan single-molekyle FRET-spektroskopi anvendes til at udlede afstande, der er nøjagtige nok til at anvendes til distansbegrænset strukturel modellering ²⁶ . Dette er muligt ved at udnytte multiparameterfluorescensdetektion (MFD) ^{28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42} , som udnytter otte dimensioner af fluorescensinformation ( dvs. excitationsspektrum, fluorescensspektrum, anisotropi, fluorescenslevetid, fluorescensekvantumudbytte, Makroskopisk tid, fluorescensintensiteterne og afstanden mellem fluoroforer) til præcist og præcist at tilvejebringe afstandsbegrænsninger. Derudover kombineres pulseret interleaved excitation (PIE) med MFD(PIE-MFD) ⁴² til overvågning af direkte excitationsacceptorfluorescens og for at udvælge enkeltmolekylehændelser, der stammer fra prøver indeholdende en 1: 1 donor-til-acceptorstøkiometri. En typisk PIE-MFD-opsætning bruger topulserede interleaved excitationslasere forbundet til et konfokalt mikroskopkrop, hvor fotonetektion er opdelt i fire forskellige kanaler i forskellige spektrale vinduer og polarisationsegenskaber. Flere detaljer findes i figur 1 .

Det er vigtigt at bemærke, at FRET skal kombineres med beregningsmetoder for at opnå atomistiske strukturelle modeller, der er i overensstemmelse med FRET-resultaterne ^{26 , 30} . Det er ikke målet med den nuværende protokol at gå over den tilknyttede metode til at opbygge strukturelle modeller med FRET-afledte afstande. Disse fremgangsmåder er imidlertid blevet anvendt i kombination med andre teknikker ( fx røntgenspredning med små vinklerIng eller elektron paramagnetisk resonans), der føder området for integrativ strukturel biologi ^{43 , 44 , 45 , 46} . Det nuværende mål er at bane vejen for FRET som et kvantitativt værktøj inden for strukturbiologi. Som et eksempel blev denne metode anvendt til at identificere tre konformationelle tilstande i det ligandbindende domæne (LBD) af N-methyl-D-aspartat (NMDA) -receptoren. Det endelige mål er at overvinde ovennævnte begrænsninger og at bringe FRET blandt de integrerende metoder, der anvendes til strukturel bestemmelse af biomolekyler ved at tilvejebringe målte afstande med høj præcision.