JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

Published: May 13, 2017
doi:
10.3791/55623
, , , , ,
1Department of Chemistry,Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy,Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences,University of Texas Health Science Center

Summary

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Abstract

Çok parametreli flüoresan algılama (MFD) modunda tek molekül seviyesinde Förster rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak yüksek hassasiyetli boyacılar arası mesafe ölçümlerinin nasıl yapılacağı üzerine bir protokol burada sunulmuştur. MFD, fotofizik ve deneysel eserleri azaltmak için flüoresanın tüm "boyutlarını" maksimize eder ve rijid biyomoleküllerde ~ 1Å kadar bir doğrulukla boyarmadde mesafe ölçümünü sağlar. Bu yöntem, ligand bağlanması üzerine reseptörün aktivasyonunu açıklamak için N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanının üç konformasyonel durumunun tanımlanması için kullanılmıştır. Bilinen kristalografik yapıları deneysel ölçümlerle karşılaştırırken, daha dinamik biyomoleküller için 3 A'dan küçük bir alan üzerinde anlaşmışlardır. Biyomoleküllerin tüm boyutlarını kapsayan bir dizi mesafe sınırlamaları toplamak dinamik biyomolekülün yapısal bir modelini mümkün kılabilires.

Introduction

Yapısal biyoloji çalışmalarının temel amacı, biyomoleküler makinelerin yapısı ve işlevi arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmaktır. Biyomoleküllerin ( örn., Proteinler ve nükleik asitler) ilk görsel izlenimi 1950'lerde X-ışını kristalografisi 1 , 2 ile oluştu. X-ışını kristalografisi, kristal ambalaj ile sınırlandırılmış yüksek çözünürlüklü, statik yapısal bilgiler sağlar. Bu nedenle, X-ışını yapısal modellerinin doğasında olan hareketsizliği, biyomoleküllerin dinamik doğasından kaçınır; bu, çoğu biyolojik fonksiyonları etkileyen bir faktördür 3 , 4 , 5 . Nükleer manyetik rezonans (NMR) 6 , 7 , 8 sulu solüsyonlarda yapısal modelleri çözerek problemin alternatif bir çözümünü sağlamıştır. Büyük bir avantajNMR, yapısı, dinamikleri ve fonksiyonu arasındaki gerçek ilişkileri netleştirmeye yardımcı olan biyomoleküllerin ve konformasyonel toplulukların intrensek dinamik doğasını kurtarma yeteneğidir. 3 , 4 , 5 . Bununla birlikte, NMR, numune büyüklüğü ve büyük miktarlarda numune ile sınırlı olduğundan, daha büyük sistemler için karmaşık etiketleme stratejileri gerektirir. Bu nedenle, yapısal biyolojide alternatif yöntemler geliştirmek için acilen bir ihtiyaç vardır.

Tarihsel olarak, Förster rezonans enerji transferi (FRET) 9 , yapısal biyolojide önemli bir rol oynamadı FRET'in düşük doğruluklu mesafe ölçümleri sağladığı yanılgısından dolayı. Bu protokolün amacı, FRET'in nanometre ölçeğindeki mesafeleri belirleme yeteneğini tekrar gözden geçirmektir; bu mesafeler, biyomoleküllerin yapısal modellerini oluşturmak için kullanılabilir. İlk deneysel doğrulamaFRET verimliliğine R – 6 bağımlılığının bağımlılığı, 1967'de Stryer tarafından 10 "spektroskopik cetvel" olarak çeşitli uzunluklarda poliprolinlerin ölçülmesi ile gerçekleştirildi. Benzer bir deney, 2005 yılında tek molekül seviyesinde başarılmıştır 11 . Poliprolin molekülleri ideal olmayan oldukları ortaya çıkmış ve bu nedenle çift sarmallı DNA molekülleri daha sonra kullanılmıştır 12 . Bu, kesin uzaklık ölçümleri için pencereyi açtı ve biyomoleküllerin yapısal özelliklerini tanımlamak için FRET'in kullanılması fikrini verdi.

FRET, boyanacak mesafe aralığı ~ 0.6-1.3 R 0 arasındayken optimaldir, burada R 0 Förster mesafesidir. Tek moleküllü FRET deneylerinde kullanılan tipik fluoroforlar için R 0 ~ 50 A'dır. Tipik olarak FRET, yapıları ve dinamikleri çözme ve ayırma becerisi bakımından diğer yöntemlere göre birçok avantaj sunmaktadırHeterojen sistemler: (i) Floresansın nihai hassasiyetinden dolayı, tek moleküllü FRET deneyleri 13 , 14 , 15 , 16 heterojen toplulukları bireysel üyelerin yapılarını doğrudan sayarak ve aynı anda karakterize ederek çözümleyebilir. (Ii) Kompleks reaksiyon yolakları tek moleküllü FRET çalışmalarında doğrudan çözülebilir, çünkü bir toplulukta senkronizasyona ihtiyaç yoktur. (Iii) FRET, biyolojik olarak ilgili dinamikleri içeren geniş bir yelpazede, zaman içinde 10 yılı aşan geniş bir zaman alanlarına erişebilir. (Iv) FRET deneyleri, in vitro olarak ve in vivo olarak herhangi bir çözelti koşulunda gerçekleştirilebilir. FRET'in flüoresans mikroskobu ile kombinasyonu, canlı hücrelerdeki moleküler yapıların ve etkileşimlerin incelenmesine olanak tanır 15 , 16 , </ > 17 , 18 , 19 , hatta yüksek hassasiyetle 20 . (V) FRET , neredeyse her boyutta ( örneğin, poliprolin oligomerler 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV revers transkriptaz 26 ve ribozomlar 27 ) uygulanabilir. (Vi) Son olarak, biyomoleküllerin tüm boyutlarını içeren mesafeler ağı, statik veya dinamik moleküllerin 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Bu nedenle, tek moleküllü FRET spektroskopisi, mesafeye göre sınırlandırılmış yapısal modellemede kullanılabilecek kadar hassas mesafeler türetmek için kullanılabilir. Bu, flüoresans bilgisinin sekiz boyutunu ( yani uyarma spektrumu, floresans spektrumu, anizotropi, floresans ömrü, floresan kuantum verimi, Makroskopik zaman, flüoresans yoğunlukları ve flüoroforlar arasındaki mesafe) doğru ve tam olarak mesafe sınırlamaları sağlar. Buna ek olarak, darbeli araya sokulan uyarılma (PIE), MFD(PIE-MFD) 42 ile direkt uyarım akseptörünün flüoresansını izlemek ve 1: 1 donör-toplayıcı stokiyometri içeren numunelerden kaynaklanan tek molekül olaylarını seçmek için kullanılmıştır. Tipik bir PIE-MFD kurulumu, foton algılamanın farklı spektral pencerelerde ve kutuplama özelliklerinde dört farklı kanala ayrıldığı bir konfokal mikroskop gövdesine bağlı iki palslı araya sokulmuş uyarma lazerleri kullanır. Daha fazla ayrıntı Şekil 1'de bulunabilir .

FRET'in 26 , 30 FRET sonuçları ile uyumlu atomistik benzeri yapısal modelleri elde etmek için FRET'in hesaplama yöntemleriyle birleştirilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Mevcut protokolün amacı, FRET kaynaklı mesafelerde yapısal modeller oluşturmak için ilgili metodolojiyi gözden geçirmek değildir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar diğer tekniklerle ( örn. Küçük açılı X ışını saçılmasıIng ya da elektron paramanyetik rezonans), bütünleyici yapısal biyoloji alanını doğuruyor 43 , 44 , 45 , 46 . Halihazırdaki amaç yapısal biyolojide nicel bir araç olarak FRET'in yolunu açmaktır. Bir örnek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki (LBD) üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanıldı. Nihai amaç, belirtilen sınırlamaları aşmak ve FRET'i, yüksek hassasiyette ölçülen mesafeler sağlayarak biyomoleküllerin yapısal belirlenmesi için kullanılan bütünleştirici yöntemler arasında getirmektir.

Protocol

1. PBS Tampon Hazırlama ve Oda Tedavisi NOT: Islak kimyasal deneyler yaparken bir laboratuar ceketi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Lazeri hizalarken göz koruma kullanın. PBS tampon preparasyonu 400 mL distile edilmiş suda 4.5 g Na2HPO4, 0.44 g NaH2PO4 ve 3.5 g NaCI çözündürün. 7.5 pH değerine getirin ve solüsyonu 1 saat süreyle otoklavlayarak sterilize edin (otoklav sistemine bağlı olarak). 15 mL PBS solüsyonunu alın ve 0,1 …

Representative Results

Bir MFD kurulumu (lazer çizgileri: 60 μW'da 485 nm ve 23 μW'da 640 nm, bölüm 5.1) kullanan tipik smFRET deneylerinde, floresans numunesi düşük pikomolar konsantrasyonda ( 10-12 M = 1 pM) seyreltilir ve Bir alt-nanosaniyelik lazer darbesinin uyarı hacmi boyunca serbestçe dağılmış etiketli molekülleri uyaran bir konfokal mikroskopta. Tipik bir konfokal hacim <4 femtolitre (fL) 'dir. Düşük konsantrasyonlarda, tek seferde tek bir molekül tespit ed…

Discussion

Bu çalışmada, PIE-MFD tek moleküllü FRET deneyleri kullanılarak, boyalar arası mesafeleri yüksek hassasiyetle hizalamak, kalibre etmek ve ölçmek için protokol sunulmuştur. Tüm enstrüman parametrelerini titizlikle kalibre ederek, ölçülen uzaklıkların doğruluğunu artırabilir ve Angstrom doğruluğuna erişebilirsiniz. Bunu yapmak için, daha fazla karakterizasyon için popülasyonları analiz etmek ve tanımlamak için çeşitli çok boyutlu histogramlar kullanılır. Ölçülen numunelerin kararlıl…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VJ ve HS, NIH R01 GM094246'dan VJ'ye verilen desteği onaylar. HS, Clemson Üniversitesi Yaratıcı Sorgulama Programı ve Clemson Üniversitesi'ndeki Optik Malzeme Bilimi ve Mühendisliği Teknolojileri Merkezi'nden yeni teşebbüs kredilerini onayladı. Bu proje aynı zamanda Körfez Sahil Konsorsiyumu için Keck Merkezi'nden (NIGMS Grant No.1 T32GM089657-05) Interdisciplinary Bioscience Training için bir eğitim fakültesi ve DD için Ortak İnsan Hastalıklarının Translasyonel Çalışmaları için Schissler Vakfı Topluluğu tarafından da desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmez.

Materials

charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20um
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24X60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25×36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10×10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838 (2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121 (2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the “spectroscopic ruler” revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791 (2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256 (2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. , (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792 (2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206 (2014).
  51. Li, Q., Richard, C. -. A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432 (2015).
  52. Scopes, R. K. . Protein Purification: Principles and Practice. , (1993).
  53. Desalting Column Product booklet. GE Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016)
  54. Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2007).
  55. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  56. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010)
  57. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  58. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  59. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104 (2005).
  60. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  61. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -. J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  62. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  63. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  64. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  65. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  66. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  67. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  68. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  69. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  70. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  71. Dolino, D. M., Rezaei Adariani, ., Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

Tags

Keywords: High Precision FRETSingle-moleculeBiomolecule Structure DeterminationFörster Resonance Energy TransferMultiparameter Fluorescence DetectionInterdye Distance MeasurementNMDA ReceptorConformational StatesStructural ModelDynamic Biomolecules
check_url/pt/55623?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image