Ett grundläggande mål för strukturella biologiska studier är att avlägsna förhållandet mellan biomolekylära systemers struktur och funktion. Det första visuella intrycket av biomolekyler ( t.ex. proteiner och nukleinsyror) inträffade under 1950-talet genom utveckling av röntgenkristallografi ^{1 , 2} . Röntgenkristallografi ger högupplösande, statisk strukturinformation som begränsas av kristallförpackningen. Därför illamående av röntgenstrukturen modellerar den dynamiska naturen hos biomolekylerna, en faktor som påverkar de flesta biologiska funktionerna ^{3 , 4 , 5} . Kärnmagnetisk resonans (NMR) ^{6 , 7 , 8} gav en alternativ lösning på problemet genom att lösa strukturella modeller i vattenhaltiga lösningar. En stor fördelAv NMR är dess förmåga att återvinna biomolekylernas inneboende dynamiska natur och konformationella ensembler, vilket bidrar till att klargöra de inneboende relationerna mellan struktur, dynamik och funktion ^{3 , 4 , 5} . Ändå kräver NMR, begränsad av provstorlek och stora mängder av prov, komplexa märkningsstrategier för större system. Därför finns det ett pressande behov av att utveckla alternativa metoder inom strukturell biologi.

Historiskt har Förster resonans energiöverföring (FRET) ⁹ inte spelat en viktig roll i strukturell biologi på grund av missuppfattningen att FRET ger avståndsmätningar med låg noggrannhet. Syftet med detta protokoll är att se över FRETs förmåga att bestämma avstånd på nanometerskalan, så att dessa avstånd kan användas för att bygga strukturella modeller av biomolekyler. Den första experimentella verifieringenPåverkan av R ^{– 6} beroendet på FRET-effektiviteten gjordes av Stryer 1967 ¹⁰ genom mätning av polyproliner av olika längder som en "spektroskopisk linjal". Ett liknande experiment utfördes på en-molekylenivå 2005 2005. Polyprolinmolekyler visade sig vara icke-idealiska, och sålunda användes dubbelsträngade DNA-molekyler senare ¹² . Detta öppnade fönstret för exakta avståndsmätningar och idén att använda FRET för att identifiera strukturella egenskaper hos biomolekylerna.

FRET är optimal när intervallavståndet är från ~ 0,6-1,3 R ₀ , där R ₀ är Förster-avståndet. För typiska fluoroforer som används i enkomolekyl-FRET-experiment är R0 ~ 50 Å. FRET erbjuder typiskt många fördelar gentemot andra metoder i sin förmåga att lösa och differentiera strukturerna och dynamiken iHeterogena system: (i) På grund av fluorescens ultimata känslighet kan FRET-experiment med en-molekylen ^{13 , 14 , 15 , 16} lösa heterogena ensembler genom att direkt räkna och samtidigt karakterisera strukturerna hos dess individuella medlemmar. (Ii) Komplexa reaktionsvägar kan direkt dechifieras i single-molekyl-FRET-studier eftersom ingen synkronisering av ett ensemble behövs. (Iii) FRET kan komma åt ett brett spektrum av temporära domäner som sträcker sig över tio decennier i tid och täcker en mängd olika biologiskt relevanta dynamik. (Iv) FRET-experiment kan utföras under några lösningsbetingelser, in vitro såväl som in vivo . Kombinationen av FRET med fluorescensmikroskopi möjliggör studier av molekylära strukturer och interaktioner direkt i levande celler ^{15 , 16 ,} </ Sup> ^{17 , 18 , 19} , även med hög precision ²⁰ . (V) FRET kan appliceras på system med nästan vilken storlek som helst ( t.ex. polyprolinoligomerer ^{21 , 22 , 23 , 24} , Hsp90 ²⁵ , HIV-omvänd transkriptas ²⁶ och ribosomer ²⁷ ). (Vi) Slutligen kan ett nätverk av avstånd som innehåller alla dimensionerna av biomolekylerna användas för att härleda strukturella modeller av statiska eller dynamiska molekyler ^{18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,}Ref "> 35 ^{, 36 , 37} .

Därför kan en-molekyl-FRET-spektroskopi användas för att härleda avstånd som är tillräckligt noga för att användas för distanshållen strukturell modellering ²⁶ . Detta är möjligt genom att utnyttja multiparameterfluorescensdetektering (MFD) ^{28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42} , vilken utnyttjar åtta dimensioner av fluorescensinformation ( dvs excitationsspektrum, fluorescensspektrum, anisotropi, fluorescenslivstid, fluorescenskvantumutbyte, Makroskopisk tid, fluorescensintensiteterna och avståndet mellan fluoroforer) för att exakt och exakt tillhandahålla avståndsbestämmelser. Dessutom kombineras pulserad interleaved excitation (PIE) med MFD(PIE-MFD) ^{42 för} att övervaka direkt exciteringsacceptorfluorescens och för att välja enskilda molekylhändelser som härrör från prover innehållande en 1: 1 donor-till-acceptorstökiometri. En typisk PIE-MFD-inställning använder tvåpulserade interleaved excitationslasrar kopplade till en konfokalmikroskopkropp, där fotondetektering delas upp i fyra olika kanaler i olika spektralfönster och polarisationsegenskaper. Mer detaljer finns i Figur 1 .

Det är viktigt att notera att FRET måste kombineras med beräkningsmetoder för att uppnå atomistiska strukturella modeller som överensstämmer med FRET-resultat ^{26 , 30} . Det är inte målet med det nuvarande protokollet att gå över den associerade metoden för att bygga strukturella modeller med FRET-avledda avstånd. Dessa tillvägagångssätt har dock tillämpats i kombination med andra tekniker ( t ex röntgenspridning med lilla vinklarIng eller elektron paramagnetisk resonans), som ger upphov till fältet för integrerande strukturbiologi ^{43 , 44 , 45 , 46} . Det nuvarande målet är att bana väg för FRET som ett kvantitativt verktyg inom strukturell biologi. Som ett exempel användes denna metod för att identifiera tre konformationella tillstånd i den ligandbindande domänen (LBD) hos N-metyl-D-aspartat (NMDA) -receptorn. Det ultimata målet är att övervinna ovan nämnda begränsningar och att föra FRET bland de integrerade metoderna som används för strukturell bestämning av biomolekyler genom att ge uppmätta avstånd med hög precision.