Un objetivo fundamental de los estudios de biología estructural es desentrañar la relación entre la estructura y la función de las máquinas biomoleculares. La primera impresión visual de las biomoléculas ( por ejemplo, proteínas y ácidos nucleicos) se produjo en la década de 1950 a través del desarrollo de la cristalografía de rayos X ^{1 , 2} . La cristalografía de rayos X proporciona información estructural estática de alta resolución restringida por el empaque de cristal. Por lo tanto, la inmovilidad inherente de los modelos estructurales de rayos X evita la naturaleza dinámica de las biomoléculas, un factor que afecta a la mayoría de las funciones biológicas [ ^{3 , 4 , 5]} . La resonancia magnética nuclear (RMN) ^{6 , 7 , 8} proporcionó una solución alternativa al problema resolviendo modelos estructurales en soluciones acuosas. Una gran ventajaDe la RMN es su capacidad para recuperar la naturaleza intrínseca dinámica de las biomoléculas y conjuntos conformacionales, lo que ayuda a aclarar las relaciones intrínsecas entre la estructura, la dinámica y la función ^{3 , 4 , 5} . Sin embargo, la RMN, limitada por el tamaño de la muestra y grandes cantidades de muestra, requiere complejas estrategias de etiquetado para sistemas más grandes. Por lo tanto, existe una necesidad acuciante de desarrollar métodos alternativos en biología estructural.

Históricamente, la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) ⁹ no ha tenido un papel importante en la biología estructural debido a la idea errónea de que FRET proporciona medidas de distancia de baja precisión. Es el propósito de este protocolo revisar la capacidad de FRET para determinar las distancias en la escala nanométrica, de tal manera que estas distancias pueden ser utilizadas para construir modelos estructurales de biomoléculas. El primer experimento verificLa dependencia de R ^{– 6 de la} eficiencia de FRET fue realizada por Stryer en 1967 ¹⁰ midiendo poliprolinas de varias longitudes como una "regla espectroscópica". Un experimento similar se llevó a cabo a nivel de una sola molécula en 2005 [ ^11] . Las moléculas de poliprolina resultaron ser no ideales y, por lo tanto, las moléculas de ADN de doble cadena se utilizaron más tarde ¹² . Esto abrió la ventana para medidas de distancia precisas y la idea de utilizar FRET para identificar las propiedades estructurales de las biomoléculas.

FRET es óptimo cuando el rango de distancia entre interditos es de ~ 0.6-1.3 R ₀ , donde R ₀ es la distancia de Förster. Para fluoróforos típicos usados ​​en experimentos de FRET de molécula única, R $ . $ Es de aproximadamente 50 Å. Típicamente, FRET ofrece muchas ventajas sobre otros métodos en su capacidad de resolver y diferenciar las estructuras y la dinámica enHeterogéneos: i) Debido a la máxima sensibilidad de la fluorescencia, los experimentos FRET de una sola molécula ^{13 , 14 , 15 , 16} pueden resolver conjuntos heterogéneos contando directamente y caracterizando simultáneamente las estructuras de sus miembros individuales. (Ii) Las vías de reacción complejas pueden ser descifradas directamente en estudios FRET de molécula única porque no es necesaria la sincronización de un conjunto. (Iii) FRET puede acceder a una amplia gama de dominios temporales que abarcan más de 10 décadas en el tiempo, cubriendo una amplia variedad de dinámicas biológicamente relevantes. (Iv) Los experimentos de FRET pueden realizarse en cualquier condición de solución, tanto in vitro como in vivo . La combinación de FRET con microscopía de fluorescencia permite el estudio de estructuras moleculares y las interacciones directamente en las células vivas [ ^{15 , 16 ,} </ Sup> ^{17 , 18 , 19} , incluso con alta precisión ²⁰ . (V) FRET se puede aplicar a sistemas de casi cualquier tamaño ( por ejemplo, oligómeros de poliprolina ^{21 , 22 , 23 , 24} , Hsp9025, transcriptasa inversa ^{26 de} HIV y ribosomas ²⁷ ). (Vi) Por último, una red de distancias que contiene toda la dimensionalidad de las biomoléculas podría utilizarse para derivar modelos estructurales de moléculas estáticas o dinámicas ^{18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,}Ref "> 35 ^{, 36 , 37} .

Por lo tanto, la espectroscopia FRET de una sola molécula se puede utilizar para derivar distancias que son lo suficientemente precisas para ser utilizado para modelado estructural restringido a distancia [ ^26] . Esto es posible aprovechando la detección de fluorescencia multiparámetro ^{28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42} , que utiliza ocho dimensiones de información de fluorescencia ( es decir, espectro de excitación, espectro de fluorescencia, anisotropía, duración de la fluorescencia, rendimiento cuántico de fluorescencia, El tiempo macroscópico, las intensidades de fluorescencia y la distancia entre los fluoróforos) para proporcionar con exactitud y precisión las restricciones de distancia. Además, la excitación intercalada pulsada (PIE) se combina con MFD(PIE-MFD) ⁴² para monitorear la fluorescencia del aceptor de excitación directo y seleccionar eventos de molécula única que surgen de muestras que contienen una estequiometría de donante a aceptor de 1: 1. Una configuración típica de PIE-MFD usa láseres de excitación entrelazados de dos pulsos conectados a un cuerpo de microscopio confocal, donde la detección de fotones se divide en cuatro canales diferentes en diferentes ventanas espectrales y características de polarización. Más detalles se pueden encontrar en la Figura 1 .

Es importante señalar que FRET debe combinarse con métodos computacionales para lograr atomístico-como los modelos estructurales que son coherentes con los resultados FRET ^{26 , 30} . No es el objetivo del presente protocolo revisar la metodología asociada para construir modelos estructurales con distancias derivadas de FRET. Sin embargo, estos enfoques se han aplicado en combinación con otras técnicas ( por ejemplo, dispersión de rayos X de ángulo pequeñoO la resonancia paramagnética electrónica), dando origen al campo de la biología estructural integradora ^{43 , 44 , 45 , 46} . El objetivo actual es allanar el camino para FRET como una herramienta cuantitativa en biología estructural. Como ejemplo, esta metodología se utilizó para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando (LBD) del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). El objetivo final es superar las limitaciones antes mencionadas y traer FRET entre los métodos integradores utilizados para la determinación estructural de biomoléculas proporcionando distancias medidas con alta precisión.