Основная цель исследований в области структурной биологии – раскрыть связь между структурой и функцией биомолекулярных машин. Первое визуальное впечатление о биомолекулах ( например, белках и нуклеиновых кислотах) произошло в 1950-х годах благодаря развитию рентгеновской кристаллографии ^{1 , 2} . Рентгеновская кристаллография обеспечивает статическую структурную информацию с высоким разрешением, ограниченную упаковкой кристалла. Таким образом, присущая иммобильность рентгеноструктурных моделей избегает динамической природы биомолекул, фактора, который влияет на большинство биологических функций ^{3 , 4 , 5} . Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) ^{6 , 7 , 8} предоставил альтернативное решение проблемы путем решения структурных моделей в водных растворах. Большое преимуществоЯМР является его способность восстанавливать внутреннюю динамическую природу биомолекул и конформационных ансамблей, что помогает прояснить внутренние взаимоотношения между структурой, динамикой и функцией ^{3 , 4 , 5} . Тем не менее, ЯМР, ограниченный размером выборки и большим количеством образца, требует сложных стратегий маркировки для более крупных систем. Поэтому существует острая необходимость в разработке альтернативных методов структурной биологии.

Исторически, резонансная передача энергии Ферстера (FRET) ⁹ не играла важной роли в структурной биологии из-за неправильного представления о том, что FRET обеспечивает низкие точности измерения расстояния. Цель этого протокола – пересмотреть способность FRET определять расстояния в нанометровом масштабе, чтобы эти расстояния можно было использовать для построения структурных моделей биомолекул. Первая экспериментальная проверкаЗависимость R ^{– 6 от} эффективности FRET была сделана Стерьером в 1967 г. ¹⁰ путем измерения полипролинов различной длины в качестве «спектроскопической линейки». Аналогичный эксперимент был выполнен на уровне одиночной молекулы в 2005 г. ¹¹ . Молекулы полипролина оказались неидеальными, и, таким образом, молекулы двухцепочечной ДНК позднее были использованы ¹² . Это открыло окно для точных измерений расстояния и идею использования FRET для определения структурных свойств биомолекул.

FRET оптимален, когда интервал расстояний между точками составляет от ~ 0,6-1,3 R ₀ , где R ₀ – расстояние Фёрстера. Для типичных флуорофоров, используемых в одномолекулярных экспериментах FRET, R ₀ ~ 50 Å. Как правило, FRET предлагает множество преимуществ по сравнению с другими методами в том, что он способен разрешать и дифференцировать структуры и динамику вГетерогенные системы: (i) Из-за предельной чувствительности флуоресценции, одномолекулярные эксперименты FRET ^{13 , 14 , 15 , 16} могут разрешать гетерогенные ансамбли, непосредственно подсчитывая и одновременно характеризуя структуры своих отдельных членов. (Ii) Комплексные пути реакции могут быть непосредственно дешифрованы в одномолекулярных FRET исследованиях, поскольку синхронизация ансамбля не требуется. (Iii) FRET может получить доступ к широкому спектру временных областей, которые охватывают более чем 10 десятилетий во времени, охватывая широкий спектр биологически релевантной динамики. (Iv) Эксперименты FRET могут быть выполнены в любых условиях растворения как in vitro, так и in vivo . Комбинация FRET с флуоресцентной микроскопией позволяет изучать молекулярные структуры и взаимодействия непосредственно в живых клетках ^{15 , 16 ,} </ Sup> ^{17 , 18 , 19} , даже с высокой точностью ²⁰ . (V) FRET может применяться к системам практически любого размера ( например, полипропиновые олигомеры ^{21 , 22 , 23 , 24} , Hsp90 ²⁵ , ВИЧ-обратная транскриптаза ²⁶ и рибосомы ²⁷ ). (Vi) Наконец, сеть расстояний, которая содержит всю размерность биомолекул, может быть использована для получения структурных моделей статических или динамических молекул ^{18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,}Ref "> 35 ^{, 36 , 37} .

Поэтому одномолекулярную FRET-спектроскопию можно использовать для получения достаточно точных расстояний, которые можно использовать для структурного моделирования с дистанционным ограничением ²⁶ . Это возможно, используя многопараметрический детектор флуоресценции (MFD) ^{28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42} , который использует восемь измерений информации флуоресценции ( то есть спектр возбуждения, спектр флуоресценции, анизотропию, время жизни флуоресценции, квантовый выход флуоресценции, Макроскопическое время, интенсивность флуоресценции и расстояние между флуорофорами) для точного и точного определения расстояний. Кроме того, импульсное чередованное возбуждение (PIE) комбинируется с MFD(PIE-MFD) ⁴² для мониторинга флуоресценции акцептора прямого возбуждения и выбора одномолекулярных событий, возникающих из образцов, содержащих стехиометрию донор-акцептор 1: 1. В типичной ПИО-МФД-установке используются двухпульсные лазеров с чередующимся возбуждением, соединенные с конфокальным корпусом микроскопа, где детектирование фотонов разбивается на четыре разных канала в разных спектральных окнах и поляризационных характеристиках. Более подробную информацию можно найти на рисунке 1 .

Важно отметить, что FRET должен сочетаться с вычислительными методами для достижения атомно-подобных структурных моделей, которые согласуются с результатами FRET ^{26 , 30} . Цель настоящего протокола не состоит в том, чтобы перейти к соответствующей методологии для построения структурных моделей с расстояниями, полученными с помощью FRET. Однако эти подходы применяются в сочетании с другими методами ( например, малоугловое рассеяние рентгеновских лучейИли электронный парамагнитный резонанс), порождая область интегративной структурной биологии ^{43 , 44 , 45 , 46} . Нынешняя цель – проложить путь для FRET как количественного инструмента в структурной биологии. В качестве примера эта методика была использована для идентификации трех конформационных состояний в лиганд-связывающем домене (LBD) рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA). Конечной целью является преодоление вышеупомянутых ограничений и привлечение FRET среди интегративных методов, используемых для структурного определения биомолекул, путем обеспечения измеренных расстояний с высокой точностью.