Um objetivo fundamental dos estudos de biologia estrutural é desvendar a relação entre a estrutura ea função das máquinas biomoleculares. A primeira impressão visual de biomoléculas ( por exemplo, proteínas e ácidos nucleicos) ocorreu na década de 1950 através do desenvolvimento de cristalografia de raios X ^{1 , 2} . A cristalografia de raios-X fornece informações estruturais estáticas de alta resolução restritas pela embalagem de cristal. Portanto, a imobilidade inerente dos modelos estruturais de raios X evita a natureza dinâmica das biomoléculas, um fator que afeta a maioria das funções biológicas ^{3 , 4 , 5} . A ressonância magnética nuclear (RMN) ^{6 , 7 , 8} proporcionou uma solução alternativa ao problema resolvendo modelos estruturais em soluções aquosas. Uma grande vantagemDe RMN é a sua capacidade de recuperar a natureza dinâmica intrínseca de biomoléculas e conjuntos conformacionais, o que ajuda a esclarecer as relações intrínsecas entre estrutura, dinâmica e função ^{3 , 4 , 5} . No entanto, a RMN, limitada pelo tamanho da amostra e grandes quantidades de amostra, requer estratégias de rotulagem complexas para sistemas maiores. Portanto, há uma necessidade premente de desenvolver métodos alternativos na biologia estrutural.

Historicamente, a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) ⁹ não assumiu um papel importante na biologia estrutural devido ao equívoco de que o FRET fornece medições de distância de baixa precisão. O objetivo deste protocolo é revisar a capacidade do FRET de determinar distâncias na escala nanométrica, de tal forma que essas distâncias possam ser utilizadas na construção de modelos estruturais de biomoléculas. O primeiro verificador experimentalA dependência da dependência de R ^{– 6} com a eficiência de FRET foi feita por Stryer em 196710, medindo poliprolinas de vários comprimentos como uma "régua espectroscópica". Um experimento semelhante foi realizado no nível de molécula única em 2005 ¹¹ . As moléculas de poliprolina revelaram-se não ideais e, assim, as moléculas de DNA de cadeia dupla foram utilizadas mais tarde ¹² . Isto abriu a janela para medidas de distância precisas ea idéia de usar FRET para identificar propriedades estruturais de biomoléculas.

FRET é óptima quando a distância interdyte varia de ~ 0,6-1,3 R ₀ , onde R ₀ é a distância de Förster. Para os fluoróforos típicos utilizados em experiências FRET de molécula única, R0 é ~ 50 Å. Tipicamente, FRET oferece muitas vantagens sobre outros métodos na sua capacidade de resolver e diferenciar as estruturas e dinâmicas emHeterogêneos: (i) Devido à sensibilidade final da fluorescência, as experiências FRET de uma única molécula ^{13 , 14 , 15 , 16} podem resolver conjuntos heterogêneos contando diretamente e caracterizando simultaneamente as estruturas de seus membros individuais. (Ii) Vias de reação complexas podem ser decifradas diretamente em estudos FRET de molécula única, porque não é necessária sincronização de um conjunto. (Iii) FRET pode acessar uma ampla gama de domínios temporais que abrangem mais de 10 décadas no tempo, cobrindo uma ampla variedade de dinâmicas biologicamente relevantes. (Iv) Experiências de FRET podem ser realizadas em quaisquer condições de solução, in vitro e in vivo . A combinação de FRET com microscopia de fluorescência permite o estudo de estruturas moleculares e interações diretamente em células vivas ^{15 , 16 ,} </ Sup> ^{17 , 18 , 19} , mesmo com alta precisão ²⁰ . (V) FRET pode ser aplicado a sistemas de praticamente qualquer tamanho ( por exemplo, oligómeros de poliprolina ^{21 , 22 , 23 , 24} , Hsp90 ²⁵ , transcriptase reversa de HIV ²⁶ e ribossomas ²⁷ ). (Vi) Finalmente, uma rede de distâncias que contém toda a dimensionalidade de biomoléculas poderia ser usada para derivar modelos estruturais de moléculas estáticas ou dinâmicas ^{18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,}Ref "> 35 ^{, 36 , 37} .

Portanto, a espectroscopia FRET de molécula única pode ser usada para derivar distâncias que são precisas o suficiente para serem usadas para modelagem estrutural restrita à distância ²⁶ . Isto é possível tirando proveito da detecção de fluorescência multiparâmetro ^{28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42} , que utiliza oito dimensões de informação de fluorescência ( isto é, espectro de excitação, espectro de fluorescência, anisotropia, tempo de vida de fluorescência, rendimento quântico de fluorescência, O tempo macroscópico, as intensidades de fluorescência e a distância entre fluoróforos) para proporcionar precisão e precisão de restrições de distância. Adicionalmente, a excitação intercalada pulsada (PIE) é combinada com MFD(PIE-MFD) ⁴² para monitorizar a fluorescência do receptor de excitação directo e para seleccionar eventos de molécula única resultantes de amostras contendo uma estequiometria de um dador para um aceitador de 1: 1. Uma configuração PIE-MFD típica usa laser de excitação intercalado de dois impulsos conectado a um corpo de microscópio confocal, onde a detecção de fótons é dividida em quatro canais diferentes em diferentes janelas espectrales e características de polarização. Mais detalhes podem ser encontrados na Figura 1 .

É importante notar que o FRET deve ser combinado com métodos computacionais para obter modelos estruturais de tipo atomístico que sejam consistentes com os resultados do FRET ^{26 , 30} . Não é o objetivo do presente protocolo examinar a metodologia associada para construir modelos estruturais com distâncias derivadas de FRET. No entanto, estas abordagens foram aplicadas em combinação com outras técnicas ( por exemplo, dispersão de raios-X de ângulo pequenoOu ressonância paramagnética eletrônica), dando origem ao campo da biologia estrutural integrativa ^{43 , 44 , 45 , 46} . O objetivo atual é abrir caminho para a FRET como ferramenta quantitativa na biologia estrutural. Como exemplo, esta metodologia foi utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando (LBD) do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). O objetivo final é superar as limitações acima mencionadas e trazer FRET entre os métodos integradores utilizados para a determinação estrutural de biomoléculas, proporcionando distâncias medidas com alta precisão.