Et grunnleggende mål for strukturelle biologistudier er å løse sammenhengen mellom strukturen og funksjonen til biomolekylære maskiner. Det første visuelle inntrykk av biomolekyler ( f.eks . Proteiner og nukleinsyrer) skjedde på 1950-tallet gjennom utviklingsrøntgenkrystallografi ^{1 , 2} . Røntgenkrystallografi gir høyoppløselig, statisk strukturell informasjon begrenset av krystallpakningen. Derfor skjuler den iboende immobiliteten til røntgenkonstruksjonsmodeller dynamisk natur av biomolekyler, en faktor som påvirker de fleste biologiske funksjoner ^{3 , 4 , 5} . Kjernemagnetisk resonans (NMR) ^{6 , 7 , 8} ga en alternativ løsning på problemet ved å løse strukturelle modeller i vandige løsninger. En stor fordelAv NMR er dets evne til å gjenopprette den indre dynamiske naturen til biomolekyler og konformasjons-ensembler, noe som bidrar til å avklare de inneboende forhold mellom struktur, dynamikk og funksjon ^{3 , 4 , 5} . Likevel krever NMR, begrenset av prøvestørrelse og store mengder prøve, komplekse merkestrategier for større systemer. Derfor er det et presserende behov for å utvikle alternative metoder i strukturell biologi.

Historisk har Forster resonans energioverføring (FRET) ⁹ ikke tatt en viktig rolle i strukturell biologi på grunn av misforståelsen at FRET gir avstandsmålinger med lav nøyaktighet. Formålet med denne protokollen er å revidere FRETs evne til å bestemme avstandene på nanometerskalaen, slik at disse avstandene kan brukes til å bygge strukturelle modeller av biomolekyler. Den første eksperimentelle verifikasjonenAtion av R ^{– 6-} avhengigheten av FRET-effektiviteten ble utført av Stryer i 1967 ¹⁰ ved måling av polyproliner av forskjellige lengder som en "spektroskopisk linjal". Et lignende eksperiment ble oppnådd på enkeltmolekylivå i 2005 ¹¹ . Polyprolinmolekyler viste seg å være ikke-ideelle, og dermed ble dobbeltstrengede DNA-molekyler senere brukt ¹² . Dette åpnet vinduet for presise avstandsmålinger og ideen om å bruke FRET for å identifisere strukturelle egenskaper av biomolekyler.

FRET er optimal når intervallavstanden er fra ~ 0,6-1,3 R ₀ , hvor R ₀ er Forster-avstanden. For typiske fluorforer som brukes i single-molekyl-FRET-eksperimenter, er R0 ~ 50 Å. FRET tilbyr vanligvis mange fordeler over andre metoder i sin evne til å løse og skille mellom strukturer og dynamikk iHeterogene systemer: (i) På grunn av den ultimative følsomheten av fluorescens kan enkeltmolekylære FRET-eksperimenter ^{13 , 14 , 15 , 16} løse heterogene ensembler ved direkte å telle og samtidig karakterisere strukturen av dets individuelle medlemmer. (Ii) Komplekse reaksjonsbaner kan direkte dechifteres i single-molecule FRET-studier fordi ingen synkronisering av et ensemble er nødvendig. (Iii) FRET kan få tilgang til et bredt spekter av tidsmessige domener som spenner over ti tiår, og dekker et bredt spekter av biologisk relevant dynamikk. (Iv) FRET-eksperimenter kan utføres i eventuelle oppløsningsbetingelser, in vitro såvel som in vivo . Kombinasjonen av FRET med fluorescensmikroskopi tillater studier av molekylære strukturer og interaksjoner direkte i levende celler ^{15 , 16 ,} </ Sup> ^{17 , 18 , 19} , selv med høy presisjon ²⁰ . (V) FRET kan påføres systemer med nesten hvilken som helst størrelse ( f.eks. Polyprolinoligomerer ^{21 , 22 , 23 , 24} , Hsp90 ²⁵ , HIV revers transkriptase ²⁶ og ribosomer ²⁷ ). (Vi) Endelig kan et nettverk av avstander som inneholder all dimensionalitet av biomolekyler brukes til å utlede strukturelle modeller av statiske eller dynamiske molekyler ^{18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,}Ref "> 35 ^{, 36 , 37} .

Derfor kan single-molecule FRET-spektroskopi brukes til å utlede avstander som er nøyaktige nok til å brukes til avstandsbestemt strukturell modellering ²⁶ . Dette er mulig ved å benytte seg av multarameterfluorescensdeteksjon (MFD) ^{28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42} , som benytter åtte dimensjoner av fluorescensinformasjon ( dvs. eksitasjonsspekter, fluorescensspektrum, anisotropi, fluorescenslevetid, fluorescenskvantumutbytte, Makroskopisk tid, fluorescensintensitetene og avstanden mellom fluoroforer) for nøyaktig og nøyaktig å gi avstandsbegrensninger. I tillegg er pulserende interleaved excitation (PIE) kombinert med MFD(PIE-MFD) ^{42 for} å overvåke direkte eksitasjonsacceptorfluorescens og å velge enkeltmolekylhendelser som oppstår fra prøver som inneholder en 1: 1 donor til akseptorstøkiometri. Et typisk PIE-MFD-oppsett bruker topulserte interleaved exciteringslasere som er koblet til en konfokal mikroskopkropp, hvor fotondeteksjon er delt inn i fire forskjellige kanaler i forskjellige spektralvinduer og polarisasjonsegenskaper. Flere detaljer finner du i Figur 1 .

Det er viktig å merke seg at FRET må kombineres med beregningsmetoder for å oppnå atomistiske strukturelle modeller som stemmer overens med FRET-resultatene ^{26 , 30} . Det er ikke målet med den nåværende protokollen å gå over den tilhørende metodikken for å bygge strukturelle modeller med FRET-avledede avstander. Imidlertid har disse tilnærmingene blitt anvendt i kombinasjon med andre teknikker ( f.eks. VinkelrønttspredningIng eller elektron paramagnetisk resonans), fødte feltet integrativ strukturell biologi ^{43 , 44 , 45 , 46} . Nåværende mål er å bane vei for FRET som et kvantitativt verktøy i strukturell biologi. Som et eksempel ble denne metoden brukt til å identifisere tre konformasjonelle tilstander i ligandbindende domene (LBD) av N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptoren. Det endelige målet er å overvinne de nevnte begrensningene og å bringe FRET blant de integrerende metodene som brukes til strukturell bestemmelse av biomolekyler ved å gi målte avstander med høy presisjon.