생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET
Summary
단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.
Abstract
다중 매개 변수 형광 검출 (MFD) 모드에서 단일 분자 수준에서 Förster 공명 에너지 전달 (FRET)을 사용하여 고정밀 interdye 거리 측정을 수행하는 방법에 대한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. MFD는 광 물리 및 실험 결과물을 줄이기 위해 형광의 모든 "차원"의 사용을 극대화하고 단단한 생체 분자에서 ~ 1Å까지의 정확도로 interdye 거리를 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 – 결합 도메인의 3 개의 구조 상태를 확인하여 리간드 결합시 수용체의 활성화를 설명하는데 사용되었다. 알려진 결정학 구조를 실험 측정과 비교할 때, 그들은 더 동적 인 생체 분자에 대해 3Å 미만으로 동의했다. 생체 분자의 전체 차원을 커버하는 일련의 거리 구속을 모으면 동적 생체 분자의 구조 모델을 제공 할 수 있습니다es.
Introduction
구조 생물학 연구의 근본적인 목표는 생체 분자 기계의 구조와 기능 사이의 관계를 밝히는 것입니다. 생체 분자 ( 예 : 단백질 및 핵산)의 첫 번째 시각적 인상은 1950 년대에 X 선 결정학 (X-Ray Crystallography) 1 , 2 를 통해 발생했습니다. X 선 결정학은 결정 포장에 의해 제약 된 고해상도 정적 구조 정보를 제공합니다. 따라서 X- 선 구조 모델의 내재적 부동성은 생체 분자의 동적 인 특성을 회피하며 이는 대부분의 생물학적 기능에 영향을 미칩니다 3 , 4 , 5 . 핵 자기 공명 (NMR) 6 , 7 , 8 은 수용액에서 구조 모델을 분석함으로써이 문제에 대한 대안적인 해결책을 제시했습니다. 큰 이점NMR은 구조, 동역학 및 기능 3 , 4 , 5 사이의 본질적인 관계를 명확히하는 데 도움이되는 생체 분자 및 구조적 앙상블의 본질적인 동적 특성을 회복 할 수있는 능력입니다. 그럼에도 불구하고 시료 크기와 많은 양의 시료에 의해 제한되는 NMR은 대형 시스템에 대한 복잡한 표지 전략을 필요로합니다. 그러므로 구조 생물학에서 대안적인 방법을 개발할 긴급한 필요가있다.
역사적으로 FRET가 낮은 정확도 거리 측정을 제공한다는 오해 때문에 Fösterster 공명 에너지 전달 (FRET) 9 는 구조 생물학에서 중요한 역할을하지 못했습니다. 이 프로토콜의 목적은 FRET가 나노 미터 규모의 거리를 결정하는 능력을 재검토하여 이러한 거리가 생체 분자의 구조 모델을 구축하는 데 사용될 수 있도록하는 것입니다. 첫 번째 실험적 검증FRET 효율에 대한 R – 6 의존성은 1967 년 Stryer가 "분광적 인 통치자"로서 다양한 길이의 폴리 프롤린을 측정함으로써 행해졌 다. 유사한 실험이 2005 년에 단일 분자 수준에서 이루어졌다. Polyproline 분자는 이상적이지 않은 것으로 밝혀졌고, 따라서 이중 가닥의 DNA 분자는 나중에 사용되었다. 이것은 정확한 거리 측정을위한 창을 열었고 FRET을 사용하여 생체 분자의 구조적 특성을 확인했습니다.
FRET은 interdye 거리 범위가 ~ 0.6-1.3 R 0 인 경우 최적입니다. 여기서 R 0 은 Förster 거리입니다. 단일 분자 FRET 실험에 사용 된 일반적인 형광체의 경우 R 0 은 ~ 50Å입니다. 일반적으로 FRET은 다른 방법보다 구조 및 역학을 해결하고 차별화 할 수있는 많은 장점을 제공합니다.(i) 형광의 궁극적 인 민감성 때문에, 단일 분자 FRET 실험 13 , 14 , 15 , 16 은 개별 구성원의 구조를 직접 세고 동시에 특성화함으로써 이질적인 앙상블을 해결할 수있다. (ii) 앙상블의 동기화가 필요 없기 때문에 단일 분자 FRET 연구에서 복잡한 반응 경로를 직접 해독 할 수 있습니다. (ⅲ) FRET는 생물학적으로 관련된 다양한 역학 관계를 다루면서 10 년 이상 시간 영역의 넓은 영역에 접근 할 수있다. (iv) FRET 실험은 in vitro 및 in vivo의 모든 용액 조건에서 수행 될 수있다. FRET와 형광 현미경의 조합은 생체 내 세포에서 직접적으로 분자 구조와 상호 작용을 연구 할 수있게합니다 15 , 16 , </ 17 , 18 , 19 , 고정밀도 20 . (v) FRET은 거의 모든 크기의 시스템 ( 예 : 폴리 프롤린 올리고머 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV 역전사 효소 26 및 리보솜 27 )에 적용 할 수 있습니다. (vi) 마지막으로, 생체 분자의 모든 차원을 포함하는 거리의 네트워크는 정적 또는 동적 분자 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35의 구조 모델을 도출하는데 사용될 수있다 .ref "> 35 , 36 , 37 .
따라서 단일 분자 FRET 분광기를 사용하여 거리가 구속 된 구조 모델링에 사용하기에 충분히 정확한 거리를 유도 할 수 있습니다 26 . 이것은 8 개 차원의 형광 정보 ( 즉, 여기 스펙트럼, 형광 스펙트럼, 이방성, 형광 수명, 형광 양자 수율, 형광 양자 효율 등)를 이용하는 다중 매개 형광 검출 (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 거시적 인 시간, 형광 강도 및 형광체 사이의 거리)를 정확하고 정확하게 거리 제한을 제공합니다. 또한, 펄스 인터리빙 된 여기 (PIE)는 MFD(PIE-MFD) (42) 를 사용하여 직접 여기 수용체 형광을 모니터하고 1 : 1 공여체 – 수용체 화학 양롞을 포함하는 샘플에서 발생하는 단일 분자 이벤트를 선택합니다. 일반적인 PIE-MFD 설정은 공 초점 현미경 몸체에 연결된 2 개의 펄스 인터리빙 된 여기 레이저를 사용합니다.이 광자 검출은 서로 다른 스펙트럼 창과 편광 특성의 4 가지 채널로 분할됩니다. 자세한 내용은 그림 1을 참조하십시오.
FRET 결과와 일치하는 원자 론적 구조 모델을 얻기 위해 FRET가 계산 방법과 결합되어야한다는 점에 유의해야한다. FRET에서 유도 된 거리를 가진 구조 모델을 구축하는 것은 관련된 방법론을 검토하는 것이 현재의 프로토콜의 목표는 아니다. 그러나 이러한 접근법은 다른 기술 ( 예 : 소각 X 선 산란ing 또는 전자 paramagnetic 공명), 통합 구조 생물학 43 , 44 , 45 , 46 의 분야를 낳았다. 현재의 목표는 구조 생물학에서 정량적 도구로서 FRET의 길을 열어주는 것입니다. 예를 들어,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 – 결합 도메인 (LBD)에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용되었다. 궁극적 인 목표는 앞서 언급 한 한계점을 극복하고 고정밀 도로 측정 된 거리를 제공함으로써 생체 분자의 구조적 결정에 사용되는 통합 방법 가운데 FRET를 가져 오는 것입니다.
Protocol
1. PBS 완충제 준비 및 챔버 처리 참고 : 습식 화학 실험을 수행 할 때는 실험실 코트와 일회용 장갑을 착용하십시오. 레이저를 정렬 할 때 눈 보호 장치를 사용하십시오. PBS 완충액 제조 400g의 증류수에 4.5g의 Na2HPO4, 0.44g의 NaH2PO4 및 3.5g의 NaCl을 용해시킨다. 7.5의 pH를 확보하고 액체 사이클에서 1 시간 동안 오토 클레이브하여 (오토 클레이브 시스템에…
Representative Results
MFD 설정 (레이저 라인 : 60 μW에서 485 nm, 23 μW에서 640 nm, 섹션 5.1)을 사용하는 전형적인 smFRET 실험에서 형광 샘플을 낮은 피코 몰 농도 (10 -12 M = 1 pM)로 희석하고 공진 현미경 (sub-nanosecond laser pulse)은 여기 볼륨 (excitation volume)을 통해 자유롭게 확산되는 라벨 분자를 여기시킨다. 일반적인 공 초점 부피는 <4 펨토텔 (fL)입니다. 그러한 저농도에서는 한 번에 하나의 분…
Discussion
이 연구에서는 PIE-MFD 단일 분자 FRET 실험을 사용하여 interdye distance를 고정밀 도로 정렬, 교정 및 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 모든 기기 파라미터를 신중하게 교정하여 측정 된 거리의 정확도를 높이고 Angstrom 정확도에 도달 할 수 있습니다. 이를 위해 다양한 다차원 히스토그램을 사용하여 추가 특성 분석을위한 모집단을 분석하고 식별합니다. 측정 된 샘플의 안정성을 확인하기 위해 평균 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VJ와 HS는 NIH R01 GM094246에서 VJ 로의 지원을 인정합니다. HS는 Clemson University 창의적 탐구 프로그램 및 Clemson University의 광학 재료 과학 및 엔지니어링 기술 센터로부터 창업 자금을 인정합니다. 이 프로젝트는 걸프 코스트 컨소시엄의 학제 간 생물 과학 교육 센터 (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05)의 켁 센터 (Keck Center)와 일반적인 인간 질병의 번역 연구를위한 시스 손 재단 파운데이션 (Schissler Foundation Fellowship)의 연수 프로그램도 지원했다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| charcoal | Merck KGaA | K42964486 320 | |
| syringe filter | Fisherbrand | 09-719C | size: 0.20um |
| chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | 1.5 borosilicate glass, 8 wells |
| microscope cover glass | Fisher Scientific | 063014-9 | size: 24X60-1.5 |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 148859 | nuclease free |
| tween-20 | Thermo Scientific | 28320 | 10% solution of Polysorbate 20 |
| acceptor DNA strand (High FRET) | Integrated DNA Technologies | 178124895 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| acceptor DNA strand (Low FRET) | Integrated DNA Technologies | 177956424 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| donor DNA strand | Integrated DNA Technologies | 177951437 | 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG) |
| DNA strand (No FRET) | Integrated DNA Technologies | 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) | |
| thermal cycler | Eppendorf | E6331000025 | nexus gradient |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Thermo Scientific | A10254 | termed cyan-green fluorophore in the manuscript |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Thermo Scientific | A20347 | termed far-red fluorophore in the manuscript |
| Rhodamine 110 | Sigma-Aldrich | 83695-250MG | |
| Rhodamine 101 | Sigma-Aldrich | 83694-500MG | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | For culture of E. coli |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection |
| Tetracyline | Calbiochem | 58346 | Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation |
| Origami B(DE3) Competent Cells | Millipore | 70837-3 | Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755 | For induction of E. coli protein expression |
| HiTrap Chelating HP | GE Life Sciences | 17-0409-01 | For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| PD-10 Desalting Column | GE Life Sciences | 17-0851-01 | |
| AktaPurifier | GE Life Sciences | 28406264 | FPLC Instrument |
| Dialysis tubing | Spectrum labs | 132562 | 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll |
| Dichroics | Semrock | FF500/646-Di01-25×36 | 500/646 BrightLight |
| 50/50 Beam splitter polarizer | Qioptiq Linos | G33 5743 000 | 10×10 film polarizer |
| Green pass filer | Chroma | ET525/50m | ET525/50m 25 mm diameter mount |
| Red pass filter | Chroma | ET720/150m | ET720/150m 25 mm diameter mount |
| Power Meter | ThorLabd | PM200 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary300Bio | |
| Fluorolog 3 fluorometer | Horiba | FL3-22-R3 | |
| Fluorohub TCSPC controller | Horiba | Fluorohub-B | TCSPC electronics for ensemble measurements |
| NanoLed 485L | Horiba | 485L | Blue diode laser |
| NanoLed 635L | Horiba | 635L | Red diode laser |
| Olympus IX73 Microscope | Olympus | IX73P2F | Microscope frame |
| PMA 40 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932200, PMA 40 | Optimized for green detection |
| PMA 50 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932201, PMA 50 | Optimized for ed shifter sensitivity |
| 485nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-485 | |
| 640nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-640 | |
| Hydraharp 400 and TTTR acqusition software | PicoQuant | 930021 | Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software |
| SEPIA II SLM 828 and SEPIA software | PicoQuant | 910028 | Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller. |
| computer | Dell | optiplex 7010 | cpu: i7-3770 ram:16GB |
| FRET Positioning and Screening (FPS) software | Heinrich Heine Unviersity | It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html | |
| MFD suite | Heinrich Heine Unviersity | It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html |
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Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).