構造生物学研究の基本的な目的は、生体分子機械の構造と機能との関係を解明することである。生体分子（ 例えば、タンパク質や核酸）の最初の視覚的印象は、1950年代にX線結晶構造解析^1,2によって生じました。 X線結晶解析は、結晶充填によって制約される高分解能、静的構造情報を提供する。したがって、X線構造モデルの固有の不動性は、ほとんどの生物学的機能に影響を及ぼす因子である生体分子の動的性質を排除する3,4,5。核磁気共鳴（NMR） ^{6,7,8 は、}水溶液中の構造モデルを分解することによって、この問題に対する代替の解決法を提供した。大きな利点NMRは、構造、力学、および機能3,4,5の間の内在的な関係を明確にするのに役立つ、生体分子および立体構造アンサンブルの固有の動的性質を回復する能力である。それにもかかわらず、NMRは、試料の大きさおよび試料の大量によって制限され、より大きなシステムのための複雑な標識方法を必要とする。したがって、構造生物学における代替法を開発することが急務である。

歴史的に、フォルスター共鳴エネルギー移動（FRET） ⁹は、FRETが低精度の距離測定を提供するという誤解のために、構造生物学において重要な役割を果たしていない。このプロトコールの目的は、FRETがナノメートルスケールでの距離を決定する能力を再考することであり、そのような距離は、生体分子の構造モデルを構築するために使用することができる。最初の実験的検証FRET効率に対するR ^{– 6}依存の変化は、様々な長さのポリプロリンを「分光学的定規（spectroscopic ruler）」として測定することにより、1967年にStryerによって行われた。同様の実験が2005年の単一分子レベルで達成された¹¹ 。ポリプロリン分子は理想的ではないことが判明したので、後で二本鎖DNA分子を使用した。これにより、正確な距離測定のためのウィンドウが開き、FRETを使用して生体分子の構造特性を同定するというアイデアが開かれました。

眼間距離範囲が〜0.6〜1.3 R ₀である場合、FRETは最適である。ここで、R ₀はフォルスター距離である。単一分子FRET実験に用いられる典型的なフルオロフォアについては、 R ₀は約50Åである。典型的には、FRETは、他の方法よりも多くの利点を提供し、その構造および動態を（i）蛍光の究極の感度のために、単分子FRET実験13,14,15,16は、個々のメンバーの構造を直接的に計数し同時に特徴付けることにより、異種アンサンブルを分解することができる。 （ii）複雑な反応経路は、アンサンブルの同期化が必要ないため、単一分子FRET研究で直接解読することができる。 （iii）FRETは、10年以上にわたる幅広い時間的領域にアクセスし、生物学的に関連する様々なダイナミクスをカバーすることができる。 （iv）FRET実験は、 インビトロおよびインビボの任意の溶液条件で行うことができる。 FRETと蛍光顕微鏡との組み合わせは、生きた細胞の分子構造および相互作用の直接的な研究を可能にする^{15,16 、} </高精度²⁰であっても¹⁷ ° ^{、 18} ° ^{、 19 °で}ある。 （v）FRETは、ほぼ任意のサイズの系（ 例えば、ポリプロリンオリゴマー21,22,23,24、Hsp90 ²⁵ 、HIV逆転写酵素²⁶ 、およびリボソーム²⁷ ）に適用することができる。 （vi）最後に、生体分子のすべての次元性を含む距離のネットワークを用いて、静的分子または動的分子18,28,29,30,31,32,33,34,36の構造モデルを導出することができる。ref "> 35,36,37。

したがって、単一分子FRET分光法を使用して、距離制限構造モデル^26に使用するのに十分正確な距離を導出することができます。これは、8つの次元の蛍光情報（ すなわち、励起スペクトル、蛍光スペクトル、異方性、蛍光寿命、蛍光量子収率など）を利用するマルチパラメータ蛍光検出（MFD）28,38,39,40,41,42を利用することによって可能である。巨視的時間、蛍光強度、および蛍光体間の距離）を正確かつ正確に提供して、距離制限を提供する。さらに、パルスインターリーブド励起（PIE）は、MFD（PIE-MFD） ⁴²を用いて、直接励起アクセプター蛍光をモニターし、1：1ドナー – アクセプター化学量論を含むサンプルから生じる単一分子事象を選択する。典型的なPIE-MFDセットアップは、共焦点顕微鏡本体に接続された2パルスインターリーブ励起レーザーを使用し、光子検出は、異なるスペクトル窓および偏光特性の4つの異なるチャネルに分割される。詳細は図1を参照してください。

FRETは、FRET結果26,30と一致する原子的様構造モデルを達成するために、計算方法とFRETを組み合わせなければならないことに注意することが重要です。現在の議定書の目標は、関連する方法論を踏襲して、FRETに由来する距離を有する構造モデルを構築することではない。しかしながら、これらのアプローチは、他の技術（ 例えば、小角X線散乱または電子常磁性共鳴）、統合的な構造生物学の分野を生み出す43,44,45,46。現在の目標は、構造生物学の定量的ツールとしてFRETの道を開くことです。一例として、この方法を用いて、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメイン（LBD）における3つの構造状態を同定した。最終的な目的は、前述の限界を克服し、測定距離を高精度で提供することによって生体分子の構造決定に使用される統合的方法の中でFRETをもたらすことである。