JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

Published: May 13, 2017
doi:
10.3791/55623
, , , , ,
1Department of Chemistry,Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy,Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences,University of Texas Health Science Center

Summary

פרוטוקול דיוק גבוהה ניסויים FRET ברמת מולקולה אחת מוצגת כאן. בנוסף, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי לזהות שלושה מצבי קונפורמציה בתחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA). קביעת מרחקים מדויקים היא הצעד הראשון לקראת בניית מודלים מבניים המבוססים על ניסויים סריג.

Abstract

פרוטוקול על איך לבצע דיוק גבוהה מדידות מרחק interdye באמצעות העברת אנרגיה תהודה Förster (סריג) ברמת מולקולה אחת במצב multifarameter פלואורסצנטי (MFD) מוצג כאן. MFD ממקסם את השימוש של כל "ממדים" של הקרינה כדי להפחית חפצים מלאכותיים photophysical ומאפשר למדידת המרחק interdye עם דיוק עד ~ 1 ב ביומולקולות נוקשה. שיטה זו שימשה לזיהוי שלושה מצבי קונפורמציה של תחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA) כדי להסביר את הפעלת הקולטן על ליגנד מחייב. כאשר משווים את מבנים קריסטלוגרפיים ידוע עם מדידות ניסיוני, הם הסכימו בתוך פחות מ 3 עבור ביומולקולות דינמי יותר. איסוף קבוצה של מעצורים המרחק המכסה את כל ממדי של biomolecules יאפשר לספק מודל מבני של biomolecul דינמיEs.

Introduction

המטרה הבסיסית של מחקרים ביולוגיים מבניים היא לפענח את הקשר בין המבנה לתפקוד של מכונות biomolecular. הרושם החזותי הראשון של ביומולקולות ( למשל, חלבונים וחומצות גרעין) התרחש בשנות החמישים באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן של פיתוח רנטגן 1 , 2 . קריסטלוגרפיה רנטגן מספק ברזולוציה גבוהה, מידע מבניים סטטי מוגבל על ידי האריזה גביש. לכן, חוסר הקיום הטמון של מודלים מבניים רנטגן shuns את הטבע הדינמי של biomolecules, גורם המשפיע על פונקציות ביולוגיות ביותר 3 , 4 , 5 . תהודה מגנטית גרעינית (תמ"ג) 6 , 7 , 8 סיפק פתרון חלופי לבעיה על ידי פתרון מודלים מבניים בתמיסות מימיות. יתרון גדולשל תמ"ג היא היכולת שלו לשחזר את הטבע הדינמי הפנימי של biomolecules והרכבים קונפורמציה, אשר מסייע להבהיר את היחסים המהותיים בין המבנה, הדינמיקה, ואת הפונקציה 3 , 4 , 5 . עם זאת, תמ"ג, המוגבל על ידי גודל המדגם וכמויות גדולות של מדגם, דורש אסטרטגיות תיוג מורכבות עבור מערכות גדולות יותר. לכן, יש צורך דחוף לפתח שיטות חלופיות בביולוגיה מבנית.

מבחינה היסטורית, Förster תהודה העברת אנרגיה (סריג) 9 לא לקח תפקיד חשוב בביולוגיה מבנית בגלל misconception כי סריג מספק דיוק נמוך מדידות המרחק. זוהי המטרה של פרוטוקול זה כדי לבקר את היכולת של סריג כדי לקבוע מרחקים בסולם ננומטר, כך מרחקים אלה יכולים לשמש לבניית מודלים מבניים של biomolecules. הראשון ניסיוני verificAtion של תלות R – 6 על יעילות סריג נעשה על ידי Stryer ב -1967 10 על ידי מדידת polyprolines באורך שונים כמו "השליט ספקטרוסקופית". ניסוי דומה הושג ברמת מולקולה אחת בשנת 2005 11 . מולקולות פוליפרו-ליין התגלו כאי-אידיאליות, ולכן, מולקולות דנ"א בעלות גדילה כפולה שימשו מאוחר יותר 12 . זה פתח את החלון למדידות המרחק המדויק ואת הרעיון של שימוש FRET לזהות מאפיינים מבניים של ביומולקולות.

FRET הוא אופטימלי כאשר טווח המרחק interdye הוא מ ~ 0.6-1.3 R 0 , כאשר R 0 הוא המרחק Förster. עבור fluorophores טיפוסית המשמשים יחיד מולקולה ניסויים סריג, R 0 הוא ~ 50 Å. בדרך כלל, FRET מציע יתרונות רבים על פני שיטות אחרות ביכולתה לפתור ולהבדיל את המבנים ואת הדינמיקה במערכות הטרוגניות: (i) בשל הרגישות האולטימטיבית של הקרינה, יחיד מולקולה ניסויים סריג 13 , 14 , 15 , 16 יכול לפתור הרכבים הטרוגניים על ידי ספירה ישירה ובו זמנית אפיון המבנים של חבריו הפרט. (Ii) מסלולי תגובה מורכבים ניתן לפענח ישירות במחקרים מולקולה בודדת, משום שאין צורך בסנכרון של אנסמבל. (Iii) סריג יכול לגשת למגוון רחב של תחומים הזמניים כי טווח מעל 10 שנים בזמן, כיסוי מגוון רחב של דינמיקה רלוונטית ביולוגית. (IV) ניסויים סריג ניתן לבצע בכל תנאי פתרון, במבחנה, כמו גם in vivo . השילוב של סריג עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר לימוד של מבנים מולקולרית אינטראקציות ישירות תאים חיים 15 , 16 , </ Sup> 17 , 18 , 19 , אפילו עם דיוק גבוה 20 . (V) סריג ניתן ליישם מערכות כמעט בכל גודל ( למשל, olipomers polyproline 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV transcriptase 26 , ו ribosomes 27 ). (Vi) לבסוף, רשת של מרחקים המכיל את כל ממדי biomolecules יכול לשמש כדי להפיק מודלים מבניים של מולקולות סטטי או דינמי 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

לכן, ספקטרוסקופית יחיד מולקולה סריג ניתן להשתמש כדי להפיק מרחקים כי הם מדויקים מספיק כדי לשמש מודלים מבודדים מבודדים מרחוק 26 . זה אפשרי על ידי ניצול של multiparameter פלואורסצנטי איתור (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , אשר מנצל שמונה מימדים של מידע הקרינה ( כלומר, ספקטרום עירור, ספקטרום הקרינה, אניזוטרופיה, חיים הקרינה, התשואה הקוונטית פלואורסצנטי, זמן macroscopic, את עוצמות הקרינה, ואת המרחק בין fluorophores) כדי במדויק ומדויק לספק מגבלות מרחק. בנוסף, פעימה interleaved עירור (PIE) משולב עם MFD(PIE-MFD) 42 לפקח ישיר עירור ישיר פלואורסצנטי ולבחור אירועים מולקולה אחת הנובעת דגימות המכיל 1: 1 התורם ל-סטואיצ'יומטרי. התקנה טיפוסית PIE-MFD משתמשת בשני פעמי לייזרים מעורבים interleaved המחוברים לגוף מיקרוסקופ confocal, שבו זיהוי פוטון מחולק לארבעה ערוצים שונים בחלונות ספקטראליים שונים תכונות קיטוב. פרטים נוספים ניתן למצוא באיור 1 .

חשוב לציין כי סריג חייב להיות משולב עם שיטות חישוביות להשיג מודלים דמויי מבנה אטומיסטי כי הם בקנה אחד עם תוצאות סריג 26 , 30 . זה לא המטרה של הפרוטוקול הנוכחי ללכת על המתודולוגיה המשויך לבנות מודלים מבניים עם מרחקים נגזר סריג. עם זאת, גישות אלה יושמו בשילוב עם טכניקות אחרות ( למשל, זווית קטנה פיזור רנטגןIng או תהודה פרמגנטית אלקטרונים), הלידה לתחום הביולוגיה המבנית האינטגרטיבית 43 , 44 , 45 , 46 . המטרה הנוכחית היא לסלול את הדרך עבור סריג ככלי כמותי בביולוגיה מבנית. לדוגמה, מתודולוגיה זו שימשה לזיהוי שלושה מצבי קונפורמציה בתחום LigD של LDD של קולטן N-Methyl-D-aspartate (NMDA). המטרה הסופית היא להתגבר על המגבלות הנ"ל ולהביא FRET בין השיטות האינטגרטיביות המשמשים לקביעת המבנים של ביומולקולות על ידי מתן מרחקים נמדדים בדייקנות גבוהה.

Protocol

1. הכנת PBS הכנת טיפול הקאמרית הערה: ללבוש מעיל מעבדה כפפות חד פעמיות בעת ביצוע ניסויים כימיים רטובים. השתמש בהגנה על העין בעת ​​יישור הלייזר. הכנת PBS חיץ <ol style=";text-align:right;dire…

Representative Results

בניסויים SMFRET טיפוסי באמצעות הגדרת MFD (קווי לייזר: 485 ננומטר ב 60 μW ו 640 ננומטר ב 23 μW, סעיף 5.1), מדגם הקרינה הוא מדולל לריכוז נמוך picomolar (10 -12 M = 1 pM) והניח ב מיקרוסקופ confocal, שבו דופק לייזר sub-nanosecond מרגש שכותרתו מולקולות חופשי מתפזר דרך נפח עירור. נפח confocal…

Discussion

בעבודה זו, פרוטוקול ליישר, לכייל, ולמדוד interdye מרחקים עם דיוק גבוהה באמצעות PIE-MFD יחיד מולקולה ניסויים סריג מוצג. על ידי כיול קפדני של כל הפרמטרים האינסטרומנטליים, ניתן להגדיל את הדיוק של המרחקים הנמדדים ולהגיע לדיוק אנגסטרום. לשם כך, היסטוגרמות רב-ממדיות שונות משמשות ל…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VJ ו- HS מאשרים תמיכה מ- NIH R01 GM094246 ל- VJ. HS מכיר בכספי סטארט-אפ מתכנית המחקר של אוניברסיטת קלמסון, והמרכז לחומרים אופטיים במדע וטכנולוגיות הנדסיות באוניברסיטת קלמסון. פרויקט זה נתמך גם על ידי הכשרה הכשרה של מרכז קק עבור בינתחומי ביו-הכשרה של קונסורציוני חוף המפרץ (מענק NIGMS מס '1 T32GM089657-05) ואת קרן מלגות Schissler עבור מחקרים תירגוליים של מחלות נפש נפוצות ל DD. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20um
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24X60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25×36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10×10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838 (2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121 (2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the “spectroscopic ruler” revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791 (2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256 (2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. , (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792 (2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206 (2014).
  51. Li, Q., Richard, C. -. A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432 (2015).
  52. Scopes, R. K. . Protein Purification: Principles and Practice. , (1993).
  53. Desalting Column Product booklet. GE Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016)
  54. Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2007).
  55. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  56. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010)
  57. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  58. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  59. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104 (2005).
  60. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  61. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -. J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  62. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  63. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  64. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  65. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  66. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  67. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  68. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  69. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  70. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  71. Dolino, D. M., Rezaei Adariani, ., Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

Tags

Keywords: High Precision FRETSingle-moleculeBiomolecule Structure DeterminationFörster Resonance Energy TransferMultiparameter Fluorescence DetectionInterdye Distance MeasurementNMDA ReceptorConformational StatesStructural ModelDynamic Biomolecules
check_url/pt/55623?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image