Ein wesentliches Ziel der strukturellen Biologie ist es, die Beziehung zwischen Struktur und Funktion von biomolekularen Maschinen zu entschlüsseln. Der erste visuelle Eindruck von Biomolekülen ( zB Proteine ​​und Nukleinsäuren) trat in den 1950er Jahren durch die Entwicklung der Röntgenkristallographie ^{1 , 2 auf} . Die Röntgenkristallographie liefert hochauflösende, statische Strukturinformationen, die durch die Kristallpackung eingeschränkt werden. Daher scheut die inhärente Unbeweglichkeit von Röntgenstrukturmodellen die dynamische Natur von Biomolekülen, ein Faktor, der die meisten biologischen Funktionen ^{3 , 4 , 5} beeinflusst. Kernmagnetische Resonanz (NMR) ^{6 , 7 , 8} lieferte eine alternative Lösung für das Problem durch die Lösung von Strukturmodellen in wässrigen Lösungen. Ein großer VorteilVon NMR ist seine Fähigkeit, die intrinsische Dynamik von Biomolekülen und Konformationsensembles wiederherzustellen, was hilft, die intrinsischen Beziehungen zwischen Struktur, Dynamik und Funktion ^{3 , 4 , 5} zu klären. Trotzdem erfordert NMR, begrenzt durch Stichprobengröße und große Probenmengen, komplexe Etikettierungsstrategien für größere Systeme. Daher besteht ein dringender Bedarf, alternative Methoden in der Strukturbiologie zu entwickeln.

Historisch gesehen hat die Förster-Resonanz-Energieübertragung (FRET) ⁹ in der Strukturbiologie keine wichtige Rolle gehabt, weil das FRÜSSE, dass FRET mit einer geringen Genauigkeitsmessung ausgestattet ist. Es ist der Zweck dieses Protokolls, die Fähigkeit von FRET zu überprüfen, um Entfernungen auf der Nanometer-Skala zu bestimmen, so dass diese Abstände für den Aufbau von Strukturmodellen von Biomolekülen verwendet werden können. Die erste experimentelle VerifikationDie Abweichung von der R ^{– 6 –} Abhängigkeit von der FRET – Effizienz wurde von Stryer im Jahre 1967 ¹⁰ durch Messung von Polyprolinen verschiedener Längen als "spektroskopisches Lineal" durchgeführt. Ein ähnliches Experiment wurde auf der Einzelmolekül-Ebene im Jahr 2005 erreicht ¹¹ . Polyprolin-Moleküle erwiesen sich als nicht-ideal, und so wurden doppelsträngige DNA-Moleküle später verwendet ¹² . Dies öffnete das Fenster für präzise Abstandsmessungen und die Idee, FRET zu verwenden, um strukturelle Eigenschaften von Biomolekülen zu identifizieren.

FRET ist optimal, wenn der Interdye-Distanzbereich von ~ 0.6-1.3 R _{0 liegt} , wobei R ₀ der Förster-Abstand ist. Für typische Fluorophore, die in Einzelmolekül-FRET-Experimenten verwendet werden, beträgt R & _sub0 ; ~ 50 Å. Typischerweise bietet FRET viele Vorteile gegenüber anderen Methoden in seiner Fähigkeit, die Strukturen und Dynamiken zu lösen und zu differenzierenHeterogene Systeme: (i) Aufgrund der ultimativen Empfindlichkeit der Fluoreszenz können einzelne Molekül-FRET-Experimente ^{13 , 14 , 15 , 16} heterogene Ensembles durch direktes Zählen und gleichzeitiges Charakterisieren der Strukturen ihrer einzelnen Mitglieder lösen. (Ii) Komplexe Reaktionswege können in Einzelmolekül-FRET-Studien direkt entschlüsselt werden, da keine Synchronisation eines Ensembles erforderlich ist. (Iii) FRET kann auf eine breite Palette von zeitlichen Domänen zugreifen, die sich über 10 Jahrzehnte erstrecken und eine Vielzahl von biologisch relevanten Dynamiken abdecken. (Iv) FRET-Experimente können in beliebigen Lösungsbedingungen sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden. Die Kombination von FRET mit Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Untersuchung molekularer Strukturen und Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen ^{15 , 16 ,} </ Sup> ^{17 , 18 , 19} , auch mit hoher Präzision ²⁰ . (V) FRET kann auf Systeme von nahezu jeder Grße angewendet werden ( z. B. Polyprolin-Oligomere ^{21 , 22 , 23 , 24} , Hsp90 ²⁵ , HIV-Reverse-Transkriptase ²⁶ und Ribosomen ²⁷ ). (Vi) Schließlich könnte ein Netzwerk von Abständen, das alle Dimensionalitäten von Biomolekülen enthält, verwendet werden, um strukturelle Modelle von statischen oder dynamischen Molekülen ^{18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,}Ref "> 35 ^{, 36 , 37} .

Daher kann die Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie verwendet werden, um Abstände abzuleiten, die präzise genug sind, um für die Distanz-zurückhaltende Strukturmodellierung verwendet zu werden ²⁶ . Dies ist möglich, indem man die Multiparameter-Fluoreszenzdetektion (MFD) ^{28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42} , die acht Dimensionen von Fluoreszenzinformationen verwendet ( dh Anregungsspektrum, Fluoreszenzspektrum, Anisotropie, Fluoreszenzlebensdauer, Fluoreszenzquantenausbeute, Makroskopische Zeit, die Fluoreszenzintensitäten und der Abstand zwischen den Fluorophoren), um genau und präzise Abstandsbeschränkungen zu liefern. Zusätzlich wird die gepulste verschachtelte Erregung (PIE) mit MFD kombiniert(PIE-MFD) ^42, um die direkte Anregungsakzeptorfluoreszenz zu überwachen und Einzelmolekülereignisse auszuwählen, die aus Proben resultieren, die eine 1: 1-Donor-zu-Akzeptor-Stöchiometrie enthalten. Ein typischer PIE-MFD-Aufbau verwendet zwei gepulste verschachtelte Anregungslaser, die mit einem konfokalen Mikroskopkörper verbunden sind, wobei die Photonendetektion in vier verschiedene Kanäle in verschiedenen Spektralfenstern und Polarisationseigenschaften aufgeteilt wird. Weitere Details finden Sie in Abbildung 1 .

Es ist wichtig zu beachten, dass FRET mit rechnerischen Methoden kombiniert werden muss, um atomistische Strukturmodelle zu erreichen, die mit den FRET-Ergebnissen ^{26 , 30} übereinstimmen. Es ist nicht das Ziel des vorliegenden Protokolls, über die damit verbundene Methodik zu gehen, um Strukturmodelle mit FRET-abgeleiteten Abständen zu erstellen. Diese Ansätze wurden jedoch in Kombination mit anderen Techniken ( z. B. Kleinwinkel-Röntgenstreuung) angewendetOder Elektronen-paramagnetische Resonanz), die Geburten des Feldes der integrativen Strukturbiologie ^{43 , 44 , 45 , 46} . Das aktuelle Ziel ist es, den Weg für FRET als quantitatives Werkzeug in der Strukturbiologie zu ebnen. Als Beispiel wurde diese Methode verwendet, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne (LBD) des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Ziel ist es, die vorgenannten Einschränkungen zu überwinden und FRET zu den integrativen Methoden zu bringen, die für die strukturelle Bestimmung von Biomolekülen verwendet werden, indem gemessene Distanzen mit hoher Präzision bereitgestellt werden.