JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

Published: May 13, 2017
doi:
10.3791/55623
, , , , ,
1Department of Chemistry,Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy,Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences,University of Texas Health Science Center

Summary

Hier wordt een protocol voor hoogwaardige FRET-experimenten op het molecuulniveau voorgesteld. Daarnaast kan deze methodologie worden gebruikt om drie conformatieve staten in het ligand-bindende domein van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren. Het bepalen van precieze afstande is de eerste stap in de richting van het opbouwen van structurele modellen op basis van FRET-experimenten.

Abstract

Hierbij wordt een protocol voor het uitvoeren van nauwkeurige interdyeafstandmetingen met behulp van Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) op het molecuulniveau in de multiparameter fluorescentiedetectie (MFD) -modus weergegeven. MFD maximaliseert het gebruik van alle "dimensies" van fluorescentie om fotofysische en experimentele artefacten te verminderen en maakt het mogelijk om de interdye afstand te meten met een nauwkeurigheid tot ~ 1 Å in stijve biomoleculen. Deze methode werd gebruikt om drie conformatieve toestanden van het ligandbindende domein van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren om de activatie van de receptor op ligandbinding te verklaren. Bij het vergelijken van de bekende kristallografische structuren met experimentele metingen, kwamen ze binnen minder dan 3 Å overeen met meer dynamische biomoleculen. Het verzamelen van een reeks afstandsbeperkingen die de volledige dimensionaliteit van de biomoleculen bedekken, zou het mogelijk maken om een ​​structureel model van dynamische biomoleculen te verschaffenes.

Introduction

Een fundamenteel doel van structurele biologische studies is om de relatie tussen de structuur en de functie van biomoleculaire machines te ontrafelen. De eerste visuele indruk van biomoleculen ( bijv. Proteïnen en nucleïnezuren) vond plaats in de jaren 1950 door middel van de ontwikkelingsröntgenkristallografie 1 , 2 . Röntgenkristallografie biedt hoge resolutie, statische structurele informatie die door de kristalverpakking wordt beperkt. Daarom verdwijnt de inherente immobiliteit van röntgenstructuurmodellen de dynamische aard van biomoleculen, een factor die de meeste biologische functies 3 , 4 , 5 beïnvloedt. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) 6 , 7 , 8 leverde een alternatieve oplossing voor het probleem door structurele modellen in waterige oplossingen op te lossen. Een groot voordeelVan NMR is het vermogen om de intrinsieke dynamische aard van biomoleculen en conformatieve ensembles te herstellen, die de intrinsieke relaties tussen structuur, dynamiek en functie 3 , 4 , 5 verduidelijken. Niettemin vereist NMR, beperkt door steekproefgrootte en grote hoeveelheden van het monster complexe labelingstrategieën voor grotere systemen. Daarom is er een dringende behoefte aan alternatieve methoden in de structurele biologie.

Historisch gezien heeft Förster resonantie energie-overdracht (FRET) 9 geen belangrijke rol in structurele biologie gezien door de misvatting dat FRET nauwkeurige afstandsmetingen levert. Het doel van dit protocol is het vermogen van FRET om de afstanden op de nanometerschaal te bepalen, te herzien, zodat deze afstanden kunnen worden gebruikt voor het opbouwen van structurele modellen van biomoleculen. De eerste experimentele verificatieDe toewijzing van de R6 – afhankelijkheid van de FRET-efficiëntie is in 1967 door Stryer uitgevoerd door polyprolines van verschillende lengtes te meten als een spectroscopische liniaal. Een soortgelijk experiment werd in 2005 op het enkelmolecuulniveau bereikt. Polyproline moleculen bleken niet ideaal te zijn, en dus werden dubbelstrengs DNA-moleculen later 12 gebruikt. Dit heeft het venster geopend voor nauwkeurige afstandsmetingen en het idee om FRET te gebruiken om structurele eigenschappen van biomoleculen te identificeren.

FRET is optimaal wanneer de afstandsafstand tussen de afstanden van 0,6-1,3 R 0 is , waarbij R 0 de Förster-afstand is. Voor typische fluoroforen die worden gebruikt in single-molecule FRET experimenten, is R0 ~ 50 Å. FRET biedt typisch veel voordelen ten opzichte van andere methoden in het vermogen om de structuren en dynamiek in te lossen en te differentiërenHeterogene systemen: (i) Door de ultieme gevoeligheid van fluorescentie kunnen single-molecule FRET-experimenten 13 , 14 , 15 , 16 heterogene ensembles oplossen door de structuren van zijn individuele leden direct te tellen en tegelijkertijd te karakteriseren. (Ii) Complexe reactiewegen kunnen direct worden ontcijferd in single-molecule FRET-studies omdat er geen synchronisatie van een ensemble nodig is. (Iii) FRET kan toegang krijgen tot een breed scala van temporale domeinen die ruim 10 decennia in de tijd liggen, en omvatten een breed scala aan biologisch relevante dynamieken. (Iv) FRET-experimenten kunnen worden uitgevoerd in elke oplossing, zowel in vitro als in vivo . De combinatie van FRET met fluorescentiemicroscopie maakt het mogelijk om moleculaire structuren en interacties direct in levende cellen 15 , 16 , </ Sup> 17 , 18 , 19 , zelfs bij hoge precisie 20 . (V) FRET kan toegepast worden op systemen van bijna elke grootte ( bijv. Polyproline oligomeren 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV reverse transcriptase 26 en ribosomen 27 ). (Vi) Ten slotte kan een netwerk van afstanden die alle dimensionaliteit van biomoleculen bevatten, gebruikt worden om structurele modellen van statische of dynamische moleculen 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Daarom kan single-molecule FRET spectroscopie worden gebruikt om afstanden af ​​te leiden die nauwkeurig genoeg zijn om te worden gebruikt voor afstandbeperkte structurele modellering 26 . Dit is mogelijk door gebruik te maken van multiparameter fluorescentiedetectie (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , die acht dimensies van fluorescentie-informatie gebruikt ( dat wil zeggen excitatiespectrum, fluorescentie spectrum, anisotropie, fluorescentie levensduur, fluorescentie kwantumopbrengst, Macroscopische tijd, de fluorescentie-intensiteiten en de afstand tussen fluoroforen) om nauwkeurig en precies afstandbeperkingen te verschaffen. Daarnaast wordt gepulseerde interleaved excitatie (PIE) gecombineerd met MFD(PIE-MFD) 42 om directe excitatie-acceptor fluorescentie te monitoren en single-molecule gebeurtenissen te selecteren die voortvloeien uit monsters die een 1: 1 donor-to-acceptor stoichiometrie bevatten. Een typische PIE-MFD-configuratie maakt gebruik van tweepulsige interleaved excitatie-lasers die zijn verbonden met een confocaal microscooplichaam, waarbij de detectie van foton in vier verschillende kanalen wordt verdeeld in verschillende spectrale vensters en polarisatiekenmerken. Meer details zijn te vinden in figuur 1 .

Het is belangrijk om op te merken dat FRET moet worden gecombineerd met berekeningsmethoden om atomistische structurele modellen te realiseren die in overeenstemming zijn met FRET-resultaten 26 , 30 . Het is niet het doel van het onderhavige protocol om de bijbehorende methodologie over te gaan om structurele modellen te bouwen met FRET-afgeleide afstanden. Deze benaderingen zijn echter toegepast in combinatie met andere technieken ( bijv. Kleine hoek röntgenverdelingIng of electron paramagnetische resonantie), die het gebied van integratieve structurele biologie 43 , 44 , 45 , 46 bevoorraden. Het huidige doel is de weg te baan voor FRET als een kwantitatief instrument in de structurele biologie. Als voorbeeld werd deze methode gebruikt om drie conformatieve staten in het ligandbindende domein (LBD) van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren. Het uiteindelijke doel is om bovengenoemde beperkingen te overwinnen en FRET te brengen onder de integratieve methoden die worden gebruikt voor de structurele bepaling van biomoleculen door middel van gemeten afstanden met hoge precisie.

Protocol

1. PBS-buffervoorbereiding en kamerbehandeling OPMERKING: Draag een laboratoriumjas en wegwerphandschoenen bij het uitvoeren van natte chemische experimenten. Gebruik oogbescherming bij het aanpassen van de laser. PBS bufferbereiding Oplossen 4,5 g Na 2 HPO 4 , 0,44 g NaH2P04 en 3,5 g NaCl in 400 ml gedestilleerd water. Zorg voor een pH van 7,5 en steriliseer de oplossing door autoclaven op een vloeibare cyclus gedurende 1 uur (afhan…

Representative Results

In typische smFRET experimenten met behulp van een MFD setup (laser lijnen: 485 nm bij 60 μW en 640 nm bij 23 μW, sectie 5.1) wordt het fluorescentiemonster verdund tot een laag picomolaire concentratie ( 10-12 M = 1 pM) en geplaatst In een confocale microscoop, waar een sub-nanoseconde laserpuls exciterende gelabelde moleculen opwekt, die vrijwel door een excitatievolume diffunderen. Een typisch confocaalvolume is <4 femtoliters (fL). Bij zulke lage concentraties worden …

Discussion

In dit werk wordt het protocol voor het uitlijnen, kalibreren en meten van interdyeafstanden met hoge precisie met behulp van PIE-MFD single-molecule FRET-experimenten gepresenteerd. Door alle instrumentele parameters nauwkeurig te kalibreren, kan men de nauwkeurigheid van de gemeten afstanden verhogen en de nauwkeurigheid van de angstrom bereiken. Om dit te doen worden diverse multidimensionale histogrammen gebruikt om populaties te analyseren en te identificeren voor verdere karakterisering. Met behulp van de gemiddel…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VJ en HS erkennen ondersteuning van NIH R01 GM094246 naar VJ. HS erkent startfondsen uit het Clemson University Creative Research Program en het Centrum voor Optische Materialen Wetenschappen en Technologie Technologieën aan de Clemson University. Dit project werd ook ondersteund door een trainingsgemeenschap van het Keck Centrum voor Interdisciplinaire Bioscience Training van de Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) en de Schissler Foundation Fellowship voor Translational Studies of Common Human Diseases in DD. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20um
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24X60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25×36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10×10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838 (2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121 (2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the “spectroscopic ruler” revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791 (2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256 (2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. , (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792 (2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206 (2014).
  51. Li, Q., Richard, C. -. A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432 (2015).
  52. Scopes, R. K. . Protein Purification: Principles and Practice. , (1993).
  53. Desalting Column Product booklet. GE Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016)
  54. Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2007).
  55. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  56. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010)
  57. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  58. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  59. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104 (2005).
  60. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  61. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -. J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  62. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  63. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  64. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  65. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  66. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  67. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  68. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  69. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  70. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  71. Dolino, D. M., Rezaei Adariani, ., Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

Tags

Keywords: High Precision FRETSingle-moleculeBiomolecule Structure DeterminationFörster Resonance Energy TransferMultiparameter Fluorescence DetectionInterdye Distance MeasurementNMDA ReceptorConformational StatesStructural ModelDynamic Biomolecules
check_url/pt/55623?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image