Un objectif fondamental des études de biologie structurale est de démêler la relation entre la structure et la fonction des machines biomoléculaires. La première impression visuelle de biomolécules ( p. Ex., Protéines et acides nucléiques) s'est produite dans les années 1950 à travers le développement de la cristallographie aux rayons X ^{1 , 2} . La cristallographie aux rayons X fournit des informations structurales statiques à haute résolution contraintes par l'emballage en cristal. Par conséquent, l'immobilité inhérente des modèles structurels aux rayons X évite la nature dynamique des biomolécules, un facteur qui affecte la plupart des fonctions biologiques ^{3 , 4 , 5} . La résonance magnétique nucléaire (RMN) ^{6 , 7 , 8} a fourni une solution alternative au problème en résolvant des modèles structurels dans des solutions aqueuses. Un grand avantageDe la RMN est sa capacité à retrouver la nature dynamique intrinsèque des biomolécules et des ensembles conformationnels, ce qui aide à clarifier les relations intrinsèques entre structure, dynamique et fonction ^{3 , 4 , 5} . Néanmoins, la RMN, limitée par la taille de l'échantillon et de grandes quantités d'échantillons, nécessite des stratégies complexes d'étiquetage pour les grands systèmes. Par conséquent, il est urgent de développer des méthodes alternatives dans la biologie structurale.

Historiquement, le transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) ⁹ n'a pas joué un rôle important dans la biologie structurale en raison de l'idée fausse selon laquelle FRET fournit des mesures de distance à faible précision. C'est le but de ce protocole de revoir la capacité de FRET à déterminer les distances à l'échelle nanométrique, de sorte que ces distances peuvent être utilisées pour la construction de modèles structurels de biomolécules. La première vérification expérimentaleLa dépendance à la R ^{– 6 de l '} efficacité de FRET a été effectuée par Stryer en 1967 ¹⁰ en mesurant des polyprolines de différentes longueurs comme une «règle spectroscopique». Une expérience similaire a été réalisée au niveau de la seule molécule en 2005 ¹¹ . Les molécules de polyproline se sont avérées non idéales et, par conséquent, les molécules d'ADN double brin ont été utilisées plus tard ¹² . Cela a ouvert la fenêtre pour des mesures de distance précises et l'idée d'utiliser FRET pour identifier les propriétés structurelles des biomolécules.

FRET est optimal lorsque la distance de distance interdye est de ~ 0.6-1.3 R ₀ , où R ₀ est la distance de Förster. Pour les fluorophores typiques utilisés dans des expériences FRET à une seule molécule, R ₀ est de ~ 50 Å. Généralement, FRET offre de nombreux avantages par rapport à d'autres méthodes dans sa capacité à résoudre et à différencier les structures et la dynamique dansSystèmes hétérogènes: (i) En raison de la sensibilité ultime de la fluorescence, les expériences ^{1 , 14 , 15 , 16 de} FRET à une molécule ^{13 , 14 ,} peuvent résoudre des ensembles hétérogènes en comptant directement et en caractérisant simultanément les structures de leurs membres individuels. (Ii) Les voies de réaction complexes peuvent être directement déchiffrées dans les études FRET à une seule molécule car aucune synchronisation d'un ensemble n'est nécessaire. (Iii) FRET peut accéder à une large gamme de domaines temporels qui s'étend sur 10 décennies dans le temps, couvrant une grande variété de la dynamique biologiquement pertinente. (Iv) Les expériences de FRET peuvent être effectuées dans toutes les conditions de solution, in vitro aussi bien qu'in vivo . La combinaison de FRET avec microscopie à fluorescence permet d'étudier les structures moléculaires et les interactions directement dans les cellules vivantes ^{15 , 16 ,} </ Sup> ^{17 , 18 , 19} , même avec une haute précision ²⁰ . (V) FRET peut être appliqué à des systèmes de presque n'importe quelle taille ( par exemple, les oligomères de polyproline ^{21 , 22 , 23 , 24} , Hsp90 ²⁵ , la transcriptase inverse du VIH ²⁶ et les ribosomes ²⁷ ). (Vi) Enfin, un réseau de distances qui contient toute la dimension des biomolécules pourrait être utilisé pour dériver des modèles structurels de molécules statiques ou dynamiques ^{18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,}Ref "> 35 ^{, 36 , 37} .

Par conséquent, la spectroscopie FRET à une seule molécule peut être utilisée pour dériver des distances suffisamment précises pour être utilisées pour la modélisation structurelle à distance ²⁶ . Ceci est possible en profitant de la détection de fluorescence multiparamètre (MFD) ^{28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42} , qui utilise huit dimensions de l'information de fluorescence ( c'est-à-dire le spectre d'excitation, le spectre de fluorescence, l'anisotropie, la durée de vie de la fluorescence, le rendement quantique de fluorescence, Le temps macroscopique, les intensités de fluorescence et la distance entre les fluorophores) pour réparer de manière précise et précise les contraintes de distance. En outre, l'excitation entrelacée pulsée (PIE) est combinée avec MFD(PIE-MFD) ⁴² pour surveiller la fluorescence de l'accepteur d'excitation directe et pour sélectionner les événements d'une seule molécule découlant d'échantillons contenant une stoechiométrie donateur-accepteur 1: 1. Une configuration typique de PIE-MFD utilise des lasers d'excitation entrelacés à deux impulsions connectés à un corps de microscope confocal, où la détection de photons est divisée en quatre canaux différents dans différentes fenêtres spectrales et caractéristiques de polarisation. Vous trouverez plus de détails dans la Figure 1 .

Il est important de noter que FRET doit être combiné avec des méthodes de calcul pour obtenir des modèles structurels atomiques compatibles avec les résultats FRET ^{26 , 30} . Ce n'est pas l'objectif du protocole actuel de passer en revue la méthodologie associée pour construire des modèles structurels avec des distances dérivées de FRET. Cependant, ces approches ont été appliquées en combinaison avec d'autres techniques ( p. Ex., La dispersion des rayons X à angle petitOu la résonance paramagnétique électronique), donnant naissance au domaine de la biologie structurale intégrative ^{43 , 44 , 45 , 46} . L'objectif actuel est d'ouvrir la voie à FRET en tant qu'outil quantitatif en biologie structurale. À titre d'exemple, cette méthodologie a été utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand (LBD) du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Le but ultime est de surmonter les limitations précitées et d'introduire FRET parmi les méthodes d'intégration utilisées pour la détermination structurale des biomolécules en fournissant des distances mesurées avec une haute précision.