通过共沉淀测量蛋白与F-肌动蛋白的结合

准备材料净化感兴趣的蛋白质（见第2部分）。 准备或购买G-肌动蛋白。 注意：G-肌动蛋白可以从多个来源分离1 ;或者，可以购买。重组的G-肌动蛋白（在5mM Tris pH 8.0,0.2mM CaCl 2，0.2mM ATP（三磷酸腺苷）和0.5mM二硫苏糖醇（DTT）中）应该被快速冷冻，储存在-80℃和> 10mg / mL在小（10-20μL）等分试样中，并在使用前解冻。不要将G-肌动蛋白等分试样重新冷冻。 准备或购买对照蛋白，如BSA（参见步骤4.4）。 制备10倍聚合缓冲液（200mM咪唑pH 7.0,1M KCl，20mM MgCl 2，5mM ATP和10mM EGTA（乙二醇 – 双（β-氨基乙基醚）-N，N，N'四乙酸））。制成10x原料，加入ATP后调节pH值，必要时。等分（25μL是有用的体积）并存储在-80＆＃176℃。 制备10x反应缓冲液（200mM咪唑pH 7.0,1.5M NaCl，20mM MgCl 2，5mM ATP和10mM EGTA）。制成10x原料，加入ATP后调节pH值，必要时。等分试样（50-100μL是有用的体积），并储存在-80℃。 注意：反应缓冲液的组成是柔性的，可能需要调整以减少背景沉淀，限制非特异性结合和/或改善结合（步骤1.5.1-1.5.3）。 调整反应缓冲液的pH值在6和8之间以优化蛋白质的稳定性。在较低或较高的pH值下，用适当的缓冲液代替咪唑。 注意：使用pH 7.0作为起点，除非蛋白质需要更低或更高的pH值才能稳定。不要使用pH低于6.0或高于8.0的缓冲液，因为这可能会扰乱肌动蛋白。推荐的缓冲液（终浓度和最佳pH列出）包括：20mM MOPS（3-（ N-吗啉代）丙磺酸），pH= 6.5; 20mM咪唑，pH = 7.0; 10mM HEPES（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸），pH = 7.5;和20mM Tris，pH = 8.0。 根据测定的需要，改变反应缓冲液的盐浓度。 注意：肌动蛋白是一种酸性蛋白质，几乎所有的肌动蛋白结合蛋白在一定程度上依赖于与肌动蛋白相关的静电相互作用。因此，在大多数情况下，增加盐浓度会降低肌动蛋白的结合。反应缓冲液使用生理盐水（150 mM NaCl，工作浓度），这是推荐的起点。如果需要，盐浓度可以降低（ 例如， 100mM）以促进结合或增加以限制结合。 不要改变反应缓冲液中MgCl 2 ，ATP或EGTA的浓度，除非有特定的原因。 2.准备测试蛋白质用于测定 Preparea高纯度蛋白质使用液相色谱法获得最佳效果7 。 注意：如果使用重组蛋白，应通过蛋白酶切割靶蛋白来去除大量蛋白质标签，如谷胱甘肽-S-转移酶（GST），因为它们会干扰结合。 GST还引起融合蛋白的同二聚化，这可以人为增加肌动蛋白结合的亲和力。 通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。除以消光系数;可以使用序列分析或在线工具从蛋白质序列计算消光系数。或者，使用Bradford或BCA（二喹啉酸）方法测定蛋白质浓度。 注意：对于初始实验，20-40μM的50-100μL蛋白质通常是足够的。这将允许分析低微摩尔范围内的结合，这是大多数肌动蛋白结合蛋白的有用起点。更大的一个并且通常需要较高浓度的蛋白质以产生结合曲线以计算亲和力（参见第5节）。 在使用之前，将蛋白质硬转化（在4℃下50,000-100,000xg 10分钟）以除去不溶性蛋白质的聚集体。如果是溶解度，离心后重新测量蛋白质浓度（步骤2.2）。 3.准备F-肌动蛋白从-80°C冰箱中取出G-肌动蛋白等分试样，并迅速解冻。 将10倍聚合缓冲液加入到G-肌动蛋白中至终浓度为1倍。确保1x聚合缓冲液中的G-肌动蛋白浓度至少为10-20μM，远高于临界浓度。在室温（RT）孵育1小时以使肌动蛋白聚合。 聚合后，将F-肌动蛋白储存在4℃的溶液中，保持稳定数周。在储存后再次使用F-肌动蛋白后，轻轻倒转或者将管子轻轻松开以确保所有肌动蛋白溶解并均匀分布在溶液中。 注：（可选）添加鬼笔环肽以达到摩尔比为1：1的G-肌动蛋白：鬼笔环肽。在室温下孵育30分钟，以使鬼笔环肽与F-肌动蛋白结合。鬼笔环肽稳定F-肌动蛋白并完成两件事情：（i）减少在离心过程中不沉淀的肌动蛋白的量，（ii）它允许将F-肌动蛋白稀释到临界浓度（〜0.5μM）以下如果改变F-肌动蛋白的量以产生结合曲线（参见关于测量亲和力的第5节），则是必需的。 造血细胞测定 – 基本方案注意：第4节中描述的基本方案用于确定感兴趣的蛋白质是否与F-肌动蛋白共沉淀。一旦建立了与F-肌动蛋白的结合，则可以按照第5节中描述的方案来测量该相互作用的亲和力。 通过将10x原料稀释至1x并加入DTT至终浓度为1 mM，将反应缓冲液制备成使用日。 注：（可选）在反应缓冲液中加入最终工作浓度为0.02％的聚多卡醇。波立多醇是减少非特异性背景结合并有助于防止疏水性蛋白质粘附到超速离心管的表面活性剂。 在超离心管中，将1x目的浓度的目标蛋白稀释至1x反应缓冲液中。保持样品体积低（40-60μL），以避免使用大量的蛋白质，通过使用体积小的超离心管（ 例如 ，每个保持0.2 mL的7 x 20 mm管）。 注意：由于许多肌动蛋白结合蛋白对微摩尔范围内的F-肌动蛋白具有亲和力，所以建议以2和10μM测试感兴趣的蛋白质。如果在10μM未观察到结合，则在较高浓度下不可能观察到结合。如果添加的蛋白质占最终反应体积的10-20％以上，可能需要在进行实验之前将蛋白质透析到反应缓冲液中。 将F-肌动蛋白加入到所需的最终浓度。 注意：2μM是初始实验的有用浓度，因为它远远高于临界浓度，从而保持肌动蛋白处于丝状状态。当通过SDS-PAGE（步骤4.10）分析时，它将产生可见的颗粒。 在超速离心管中准备以下控制以使测定信息丰富。 准备含有没有F-肌动蛋白的目的蛋白质的样品。确保这些样品中的蛋白质浓度与“加F-肌动蛋白”样品中的浓度相符。 注意：这些样品将确定在没有F-肌动蛋白的情况下聚集或粘附在超离心管侧面的蛋白质的量。 准备阴性对照样品以与用于感兴趣的蛋白质相同或相似的浓度。使用不含F-肌动蛋白的不结合F-肌动蛋白的对照蛋白。 注意：这是一个重要的控制，因为即使蛋白质不结合F-肌动蛋白，蛋白质可以在肌动蛋白丝和F-肌动蛋白沉淀中被“捕获”。捕获的量可以根据F-肌动蛋白源，缓冲液条件等而变化。因此，该控制应包括在所有实验中。理想情况下，对照蛋白应具有与感兴趣的蛋白质相似的分子量（ 例如 ，对于αE-连环蛋白（〜100kDa），BSA（66kDa）是适当的对照）。商业上可获得的凝胶过滤标准品制备出优异的对照蛋白质，因为它们涵盖一定范围的尺寸，并且倾向于不含聚集体。 任选地，制备含有和不含F-肌动蛋白的含有结合F-肌动蛋白的蛋白质的阳性对照样品。确保浓度类似于e蛋白质。 注意：该控制有助于证明实验条件（ 例如，制备的F-肌动蛋白，反应缓冲液和离心）允许F-肌动蛋白结合。由于造粒测定法不能检测到弱F-肌动蛋白相互作用（参见讨论），建议已知的F-肌动蛋白结合蛋白对F-肌动蛋白具有中等至弱的亲和力（ 即，在低微摩尔范围内）。纯化的F-肌动蛋白结合蛋白是可商购的。 在室温下孵育所有样品30分钟。 注意：假设感兴趣的蛋白质是稳定的，尽管可能不必要，培养时间更长。如果感兴趣的蛋白质在RT时不稳定，则样品可以在4℃下孵育。在这种情况下，可能需要较长的孵育时间。 将样品装入离心机转子。将管置于转子内，以​​帮助离心后将沉淀物重新悬浮。为此，请标记所有离心管（ 例如，带有样品编号），并将转子中的所有管放置在相同的位置（ 例如，数字朝外）。 在超速离心机中，在4℃下以100,000xg离心20分钟。 离心后，从每个管中取出3/4的上清（ 例如 ，起始体积为60μL的45μL），并与1/3体积的4x样品缓冲液（在这种情况下为15μL）混合在一个单独的微量离心管中。 用凝胶加载尖端去除剩余的上清液，注意不要打扰颗粒（可能是玻璃状斑点）。 注意：在离心机运行完成后尽快从管中除去上清液以限制分离后的蛋白质解离是重要的。同样的原因，不要用反应缓冲液清洗沉淀物。 向每个颗粒添加4/3体积的1x样品缓冲液t（如果起始体积为60μL，则为80μL）。 注意：这使得稀释与上清液相同（步骤4.8，加入1/3体积的4x样品缓冲液），允许沉淀和上清液样品之间的直接比较和测定造粒的蛋白质的百分比。 将样品缓冲液加入所有试管中，并在室温孵育至少5分钟。让颗粒置于样品缓冲液中以改善样品回收率。 用p200移液管尖端将样品研磨8-10次，通过连续洗涤管的颗粒区域重新悬浮沉淀。在研磨过程中，将移液管末端轻轻刮去，以帮助重悬。 注意：注意避免在研磨过程中将空气引入样品，因为这将导致样品缓冲液起泡，并会降低样品回收率。 研磨后将再悬浮的样品转移到微量离心管中。 </醇> 通过SDS-PAGE和考马斯染色8分析上清液和沉淀样品，每泳道加载10-15μL样品;这足以使蛋白质可视化。 注意：与F-肌动蛋白共沉淀的蛋白质将在“无F-肌动蛋白”颗粒样品中富集“加F-肌动蛋白”颗粒样品（ 图1A ）。如果蛋白质浓度在0.1-10μM范围内，则标准考马斯蓝染色足以检测。如果使用较低的蛋白质浓度来测量更高亲和力的相互作用，则可以使用胶体考马斯9或Western印迹来提高灵敏度。 图像使用扫描仪或成像系统的考马斯染色凝胶（步骤5.12）。 造粒测定 – 定量注意：如果观察到与F-肌动蛋白的特异性结合，则可以测量t的亲和力他互动。这是通过对第4节中概述的协议进行一些修改和补充来实现的。有关设计和解释结合测定的优秀指南，请参阅Pollard 10 。提供了流程图（ 图2 ），以帮助分析和量化。 确定要测试的浓度范围。 注意：浓度范围将取决于蛋白质，并且应该从低于表观K d （ 例如 1μM）的浓度延伸到足够高的饱和结合浓度。重要的是，在浓度范围的高端，多个样品的结合达到饱和，以产生精确的结合曲线（ 图1C ）。如上所述，许多肌动蛋白结合蛋白在低微摩尔范围（1-5μM）中对F-肌动蛋白具有亲和力。对于K d为0.5-1μM的蛋白质，有用的起始浓度范围为0.1-10μM。 硬旋转（步骤2.3）感兴趣的蛋白质去除聚集体。连续稀释蛋白质，使含有7-8个样品的浓度系列以2x的最终浓度测试。例如，如果要测试的范围为0.1-8μM，则在1x反应缓冲液中制备以下稀释液：16,8,4,2,1,0.5和0.2μM。 注意：如步骤4.2中所述，如果添加的蛋白质占第一稀释度的10％-20％（上述实施例中的16μM样品），可能需要进一步浓缩蛋白质或透析蛋白质转变成1x反应缓冲液。确保为“加F-肌动蛋白”和“无F-肌动蛋白”样品准备足够的每种稀释液。 通过在超离心管中的1x反应缓冲液中稀释目的蛋白质至所需浓度来制备样品（如第4部分）。保持样品体积低（40-60μL），以避免使用大量的蛋白质通过使用超薄具有最小体积（ 例如 ，每个保持0.2mL的7×20mm管）的步枪管。 将F-肌动蛋白添加到合适样品的所需最终浓度，并使用1x反应缓冲液调出体积。例如，对于使用2μMF-肌动蛋白的50μL反应，确保每个样品具有25μL的2x蛋白质，10μL的10μMF-肌动蛋白和15μL的1x反应缓冲液。包括对照样品（步骤4.4.2和4.4.3）。 注意：对于阴性和阳性对照，使用要测试的范围内的一个浓度（步骤5.1），理想情况下，接近中间至高端范围（如果浓度范围为0.1-10μM，则为4μM）。 在室温下孵育所有样品30分钟。 30分钟后，取出每个样品的1/5（ 例如， 10μL的50μL反应），并与20μL的水和10μL的4x样品缓冲液混合。 注意：这些是“总计”将用于生成标准曲线。 将样品装入超速离心机转子。在100,000 xg和4℃下离心20分钟。 离心后，取出3/4的上清液（ 如离心体积为40μL，每孔30μL），并与4x样品缓冲液（在这种情况下为10μL）混合，并分离出离心管。用凝胶加载尖端去除剩余的上清液，注意不要打扰沉淀。 注意：当测量结合亲和力时，不需要运行上清液。然而，保存上清液可能是有用的，特别是在测试新蛋白质时。 如果不分析，则取出上清液（步骤5.7）。 将沉淀重悬于1体积的1x样品缓冲液中（如果离心体积为40μL，则为40μL）。 将样品缓冲液加入所有试管中，并在室温孵育至少5分钟。 TR用p200吸头提取样品8-10次，连续洗涤管的颗粒区域。在研磨过程中，将移液管末端轻轻刮去，以帮助重悬。 将再悬浮的蛋白质转移到微量离心管中。 注意：这些是“Pellet”样品。 通过SDS-PAGE 8分析Total和Pellet样品。如果可能，运行一个凝胶上的所有样品;如果没有，在一个凝胶上运行颗粒样品，并在一秒钟内运行总样品。 注意：鉴于样品数量，推荐使用大型凝胶系统进行分析。如果在两个或多个凝胶上运行样品，重要的是所有凝胶都被染色相同（ 即，相同的考马斯溶液和相同的染色/脱色时间）。 图像考马斯染色的凝胶使用成像系统，测量宽（ 即，两到三对数）和线性范围内的蛋白质带强度。确保图像a没有饱和像素收集。 注意：基于激光的成像系统提供最佳的灵敏度和信噪比。 使用ImageJ或类似的分析程序，测量蛋白质带强度并计算结合蛋白的量。 注意：对于所有样本测量，使用ImageJ中的选择工具绘制每个频带周围的感兴趣区域（ROI），并测量（分析>测量）区域和平均灰度值。通过从没有样品的区域测量平均灰度值来计算每个凝胶的背景。从每个ROI平均灰度值减去背景平均灰度值，然后乘以面积以获得每个频带的积分密度值。 从总样本测量感兴趣的蛋白质带强度（ 图2A ）。 通过绘制带强度（ 即综合密度测量）与蛋白质质量的关系来生成标准曲线（ 图2B）。 测量与F-肌动蛋白共沉淀的感兴趣蛋白质的量（共沉淀蛋白， 图2C ）。 测量在不存在F-肌动蛋白时沉淀的感兴趣的蛋白质的量（背景沉淀， 图2D ）。 从共沉淀蛋白中减去背景沉淀（ 即从步骤5.13.3中减去步骤5.13.4的值），以确定与F-肌动蛋白结合的蛋白质的量。 测量每个颗粒中的F-肌动蛋白的量（ 图2E ）。确定每个样品的平均F-肌动蛋白量，然后将每个样品除以平均值，以确定每个样品中F-肌动蛋白与平均值之比（ 即，低于条带的数字）。 对于每个样品，通过F-肌动蛋白肌动蛋白颗粒比（步骤5.13.6）将结合的蛋白质的量（在步骤5.13.5中计算）分配以调整颗粒中的差异。 ñOTE：该值是归一化的结合蛋白。 使用标准曲线（步骤5.13.2）计算每个样品中标准化结合蛋白的量（质量）（步骤5.13.7）。 注意：最初去除的蛋白质（“总”样品）以及负载量（除了整个颗粒负载以外，将是颗粒的一部分），必须在计算蛋白质总量时考虑那颗颗粒。 从颗粒中的蛋白质总量（步骤5.13.8中计算）和样品的体积确定每个样品中结合蛋白的浓度。从起始浓度减去该值以确定游离蛋白的量。通过肌动蛋白的浓度（肌动蛋白的μM/μM）和阴性相对于游离蛋白的浓度分离结合蛋白的浓度以产生结合曲线（ 图1C ）。 注意：由于F-肌动蛋白不是单一的，均匀的物种，它是diffi从G-肌动蛋白浓度推断F-肌动蛋白的摩尔浓度。使用起始G-肌动蛋白浓度来确定结合蛋白的量（肌动蛋白的μM/μM），并估计反应中结合位点的表观浓度。结合位点的浓度通常小于反应中肌动蛋白单体的浓度，因为不是所有的肌动蛋白聚合，并且因为单个肌动蛋白结合蛋白分子可以与肌动蛋白丝上的多个单体接触。 使用统计程序，通过使用非线性最小二乘回归从结合曲线确定亲和力（K d ）和B max 。 注意：Scatchard图不鼓励用于分析结合数据，部分原因是它们可能会掩盖绑定是否饱和，并且可能会扭曲实验错误10 。