전압 클램프 형광 측정법<em> Xenopus</em> 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포
Summary
이 기사에서는 이온 채널에서 구조적 재배치를 조사하기 위해 말레이 미드 염료 대신 형광 비정상적인 아미노산 (fUAA)이 사용되는 기존의 VCF (Voltage-Clamp Fluorometry)의 향상에 대해 설명합니다. 이 절차에는 Xenopus oocyte DNA 주입, RNA / fUAA 동시 주입, 동시 전류 및 형광 측정이 포함됩니다.
Abstract
Voltage-Clamp Fluorometry (VCF)는 형광 및 전류의 실시간 측정이 국소 재배치 및 전지구 기능에 대해 동시에보고하는 전자 제 멤브레인 단백질의 구조 및 기능을 조사하기위한 기술이었습니다 1 . 저온 전자 현미경 또는 X 선 결정학과 같은 고해상도 구조 기술은 관심있는 단백질의 정적 이미지를 제공하지만 VCF는 구조적 재배치 (형광)를 동적 기능 데이터 (전기 생리학)에 연결할 수있는 동적 구조 데이터를 제공합니다. 최근까지 내재적 인 시스테인을 포함하여 접근 가능한 모든 시스테인이 분류 될 것이기 때문에 단백질의 부위 지시 형광 표지에 사용 된 티올 반응 화학은 접근법의 범위를 제한했다. 따라서 내인성 시스테인이없는 단백질을 만들어야했습니다. 표지는 또한 세포 외로부터 접근 가능한 사이트로 제한되었다측면. 이것은 직각 tRNA 및 tRNA 합성 효소 쌍을 사용하여 정지 코돈 억제에 대한 반응으로 작은 형광성 프로브를 구체적으로 통합하기 위해 형광 비 자연 아미노산 ( Fluorescent Unnatural Amino Acids , fUAA)을 사용하여 변경되었습니다. VCF 개선은 DNA 주입 (tRNA / synthetase 쌍)의 2 단계 주입 절차와 RNA / fUAA 동시 주입을 필요로합니다. 이제 세포 내 및 묻힌 부위 모두에 라벨을 붙일 수 있으며 VCF의 사용이 크게 늘어났습니다. VCF 기술은 광범위한 단백질 연구에 매력적이며, 더 중요한 것은 많은 세포질 조절 메커니즘을 연구 할 수 있다는 것입니다.
Introduction
다양한 화학적 및 물리적 특성을 지닌 200 개가 넘는 비 천연 아미노산이 대장균 , 효모 및 포유 동물 세포에서 단백질로 유 전적으로 도입되었습니다 3 . 비 천연 아미노산은 직교 조작 된 tRNA / 신테 타제 쌍을 통해 특정 종결 코돈에 반응하여 도입된다. 단백질을 수정하는 유전자 접근법은 단백질 구조와 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 여기서는 형광 UAA와 함께 전압 – 클램프 형광 측정 (VCF)을 사용하기위한 프로토콜을 제시합니다.
VCF에서 형광 프로브 주위에 위치하는 기능적 데이터와 구조적 재구성을 동시에 관찰하면 밀리 초 분해능 1의 동적 정보를 얻을 수 있습니다. 형광 프로브는 단백질의 국부적 인 움직임에 따라 급냉 상태를 변경합니다. 단지 1-2Å의 움직임만으로도 형광의 현저한 변화를 유도 할 수 있습니다강도 4 . 표적 단백질에서 관심 부위의 동정 후, 부위는 점 돌연변이에 의해 돌연변이된다. 고전적으로, 잔기는 시스테인으로 돌연변이되었지만, 지금은 황색 정지 코돈 (TAG)이 유전 fUAA 도입을 위해 도입되었다. 그 단백질은 시험 관내에서 전사된다.
다른 발현 시스템 ( 예 : 포유 동물 세포) 5 , 6 , 7 , Xenopus의 난 모세포는 구조 기능 연구에 더 큰 크기 때문에 더 쉽게 조작하고 높은 형광 강도 (더 fluorophores)로 이어질 수 있으므로, 노이즈 비율. 또한, Xenopus 난 모세포는 내인성 단백질 2 , 8 의 배경이 낮고 동물의 극 보호막에 어두운 색소가있어 t그는 세포질이다. Xenopus 난 모세포를 외과 적으로 제거하고 fUAA에 특이적인 직교 tRNA / tRNA 합성 효소 쌍을 암호화하는 DNA를 난 모세포의 핵으로 주입한다. 6-24 시간의 배양 시간 후, 단백질 RNA를 fUAA와 함께 난 모세포의 세포질에 주입하고 2-3 일간 배양한다. fUAA (photobleaching)의 손상을 방지하기 위해 적색광 하에서 형광체 여기를 피하기 위해 Anap을 포함한 절차를 수행해야합니다.
난 모세포는 직립 형광 현미경에 장착 된 컷 오픈 oocyte 전압 클램프 설정에서 연구하고, 전류와 형광 변화는 동시에 9 , 10 기록됩니다. 대안으로, 2- 전극 전압 클램프 ( 1) 또는 패치 – 클램프 구성 (11) 이 사용될 수있다. 형광은 낮은 RMS 잡음을 갖는 적절한 파장에 의해 여기되고 높은 증폭을 갖는 증폭기에 연결된 포토 다이오드를 사용하여 기록 된 방사.
전압 클램프 형광 측정법에 형광 비 천연 아미노산 (fUAAs)을 사용하면 몇 가지 장점이 있습니다. 하나는 막 단백질의 세포질 측에 대한 접근이다. 많은 조절 과정이 여기에 있습니다 ( 예 : Ca 2+ 또는 뉴클레오타이드 결합 부위, 전압 게이 티드 이온 채널의 빠른 및 폐쇄 상태 불 활성화, 기공 개방, 모듈 커플 링). 이 모든 공정에 형광 물질 표시가 가능합니다.
또 다른 이점은 작은 크기의 탐침으로 단백질의 방해가 적다는 것입니다. 지금까지, fUAA를위한 두 개의 직교 tRNA / tRNA 합성 효소 쌍이 조작 된 12 , 13 , 3- (6- 아세틸 나프탈렌 -2- 일 아미노) -2- 아미노 프로판 산 (Anap)은 Xenopus 난 모세포에서 사용 된 유일한 fUAA이다 도 2에 도시 된 바와 같이 ,"xref"> 8. Anap은 272.3 g / mol의 분자량을 지닌 환경 적으로 민감한 형광 단이며 트립토판 12 보다 약간 크다 ( 그림 1A, 1B ). 크기가 작기 때문에 링커 (일반적으로 500 g / mol 이상)를 통해 부착 된 기존 형광체와 비교하여 형광체가 입체 효과를 거의 일으키지 않습니다. 또한, Anap의 경우, 형광체는 시스테인에 연결된 것보다 단백질 백본에 더 가까이 위치하므로 결과적으로 Anap은 더 국부적 인 재배치를 탐색합니다. 마지막으로, UAA-VCF에서 부위 특이 적 표지를 보장하기 위해 기존의 VCF에서 내인성 시스테인을 제거함으로써 (i) 단백질을 (거의) 본래의 상태로두고 (ii) VCF를 적용 할 수있게한다 기능이 시스테인 치환에 의해 변경 될 수있는 더 넓은 범위의 단백질을 연구한다.
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그림 1 : Anap and Fluorescence Spectra. ( A ) Anap의 화학 구조. ( B ) 1nM 아나프에 대한 표준화 된 흡수 스펙트럼 및 방출 스펙트럼, 아나 프 형광의 용매 소수성에 대한 민감성을 입증 함. 방출 스펙트럼은 350 nm에서 여기하여 얻은 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
형광 UAA의 단점은 aminoacylated tRNA의 양이 부족하면 stop codon readthrough, translational reinitiation, C-terminal truncated proteins 또는 내인성 aminoacylation과의 crosstalk로 인해 단백질의 이종 집단이 생길 수 있다는 것입니다. 이러한 누출 발현은 fUAA와 tRNA / tRNA 합성 효소 쌍이없는 경우 항상 검사해야합니다. 우리는 트랜스의 문제를 다루었습니다.이전에 N 말단 삽입 부위에 대해 이성적 재발 및 그것을 막는 방법 14 . 그러나, fUAA, tRNA 및 tRNA 합성 효소가 포화 된 양으로 존재할 때, 누출 발현 가능성은 낮다.
fUAA-VCF와 재래식 VCF의 주요 절차상의 차이점은 난 모세포의 주입과 취급이다. tRNA 및 tRNA 합성 효소 (pAnap)를 코딩하는 DNA의 주입 후에 단백질 mRNA와 함께 주입되거나 양자 택일로 아세 톡시 메틸 (AM) 에스테르로서 배양 용액에 첨가되는 아나 (Anap)의 도입이 뒤 따른다.
Protocol
Representative Results
Discussion
tRNA 합성 효소와 함께 연속적으로 전사되는 tRNA의 생체 내 aminoacylation은 형광 측정을위한 높은 발현 수준을 얻는 것을 가능하게합니다. 효율적인 fUAA 도입을 위해서는 pAnap이 핵에 정확하게 주입되는 것이 중요합니다. 핵의 정확한 위치에 대한 불확실성 때문에 DNA 주입의 10-40 %가 실패 할 것으로 예상되어 비 – 발현 (또는 누출 – 발현) 난 모세포가 발생합니다. 그러므로 Anap과 pAnap가없는 경우…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pAnap은 Peter Schultz 박사 (Scripps Research Institute)의 친절한 선물이었습니다. 이 연구는 보건 연구 보조금 MOP-102689 및 MOP-136894 (RB에 대한) 및 캐나다 재단 혁신 기금 950-225005에 의해 자금 지원되었습니다.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
Referências
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
