Ein nicht-invasiver Weg, um Zellen aus der Conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen
Summary
Die exponierte normale Okularoberfläche besteht aus Hornhaut und Bindehaut. Epithelzellen, Becherzellen und Immunzellen sind in der Bindehaut vorhanden. Hier wird eine nicht-invasive Technik der Impressionszytologie beschrieben, die eine Impressionszytologie-Vorrichtung und Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellen in der Bindehaut verwendet.
Abstract
Traditionell wird die Augenoberflächenzytologie mit Techniken wie Spachteltechnik und Pinseltechnik untersucht. Das Problem mit diesen Techniken ist, dass sie traumatische Läsionen auf der Oberfläche des Auges induzieren können, die zu Narbenbildung, Augenliddeformität, limbischen Stammzellmangel und in einigen Fällen zu großen Unannehmlichkeiten für das Subjekt führen können. Um diese klinischen Probleme zu vermeiden, wurde die Impressionszytologie (IC) entwickelt, um eine trockene Augenerkrankung und spätere Neoplasien, atopische Erkrankungen, Frühlings-Keratokonjubotitis und Keratokonjunktivitis sicca zu diagnostizieren. Typischerweise schneiden die Kliniker die Filterpapiere manuell in die erforderlichen Formen und wenden diese auf die Augenoberfläche an. Hier beschreiben wir, wie man IC mit einem handelsüblichen medizinischen Gerät durchführt. Diese Technik wird hier erklärt, gefolgt von der Immunphänotypisierung durch Durchflusszytometrie. Diese Technik erfordert weniger manuelle Handhabung und verursacht weniger Verletzung der Augenoberfläche.
Introduction
Die Impressionszytologie (IC) wurde erstmals 1977 von Thatcher et al 1 durchgeführt . Sie benutzten eine Plastikabdruckscheibe, um konjunktivale Zellen von Patienten anstatt anderer Techniken zu sammeln, die zu diesem Zeitpunkt wie Schaben, Tupfen oder Pipettieren 1 waren . Die gegenwärtige Technik des IC verwendet ein absorbierendes Filterpapier 2, um die Bulbar und die palpebrale Bindehaut zu prägen und die oberflächlichste Schicht von Bindehautzellen zu sammeln. Diese Zellen, die ihre letzte Stufe der Differenzierung erreicht haben, werden kontinuierlich in Tränen vergossen. Drei Hauptpopulationen von Zellen finden sich in IC-Proben: Epithelzellen 4 , Becherzellen 3 , 5 und Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe viz Epithel-assoziierten Effektor-T-Zellen oder dendritischen Zellen 6 . Okulare Oberflächenzellen in IC samPles können durch Mikroskopie, Immun-Blotting und Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) 7 analysiert werden. Durchflusszytometrie wurde vor kurzem verwendet, um Immunzellen zu analysieren, die durch Schaben der IC-Membran 8 gesammelt wurden. Interessanterweise wurde IC 6 , 9 verwendet, um viele okuläre Oberflächenkrankheiten einschließlich Keratokonjunktivitis sicca, Vitamin A-Mangel, Narben-Pemphigoid, atopische Erkrankung, überlegene limbische Keratokonjunktivitis, Frühlings-Keratokonjunktivitis und epitheliale Plattenepithelmetaplasie zu bewerten. IC wurde auch verwendet, um die Auswirkungen des Tragens von Kontaktlinsen, die Erkennung von Augenmikroben zu untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit und Toleranz von therapeutischen Interventionen in Längsschnittstudien zu untersuchen 10 , 11 , 12 .
Das medizinische Gerät (EyePrim) wird von einer Art von Poly unterstütztEthersulfon (PES) 0,2 μm Membran, die bisher für die Technik der okularen Eindruckzytologie mit Durchflusszytometrie (OSIC-Flow) validiert wurde und die Möglichkeit bietet, Längsproben zu verwenden, um die Progression der Krankheit und die Reaktion auf die Behandlung zu überwachen ( z Analyse von intraepithelialen Leukozyten, die als mutmaßliche Erkrankungsmarker für die progressive Bindehautfibrose im Schleimhautpemphigoid definiert wurden) 13 . Frühe Forscher verwendeten autoklavierte PES-Filter, die manuellen Eindruck erfordern. Infolgedessen war die Ausbeute variabel und bedienungsabhängig. Der Vorteil dieses medizinischen Gerätes ist die einfache Bedienung, der standardisierte Druck (Pa oder N / m 2 ) und ermöglicht Wiederholbarkeit, Reproduzierbarkeit und gleichbleibende zelluläre Erholung. Diese Technik ist in einer ambulanten Klinik nützlich, weil sie nicht chirurgisch, leicht durchführbar und schnell ist. Dies ist ein medizinisches Gerät der Klasse I gemäß der Richtlinie 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Es erfordert nurS topische Anästhesie während des Verfahrens, die die Aufrechterhaltung der Integrität der Augenoberfläche gewährleistet. Nach IC können Zellen sofort für die Durchflusszytometrie verarbeitet werden. Darüber hinaus ist es möglich, dass nicht-ophthalmologische Techniker und Krankenschwestern trainiert werden, um die Augenoberfläche zu probieren.
Trotz der Verbesserung der IC über andere Techniken, mehrere Herausforderungen bleiben. Zum Beispiel kann es aufgrund der Fläche der Probenahme und der regionalen Unterschiede in der bulbären Konjunktiva in Abhängigkeit von der Position des IC auftreten. Eine andere Variationsquelle ist auf die Anwendung unterschiedlicher Druckmengen während des IC zurückzuführen. Andere methodische Fragen beinhalten die Standardisierung der Zellverarbeitung: Hierbei handelt es sich um Dauer und Art der Fixierung und die Bedingungen der möglichen Lagerung, die die Stabilität des Probenmaterials beeinträchtigen können.
Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, eine Methode der Isolierung der Okularabdruckproben zu entwickelnT ist einfach zu bedienen, nicht-invasiv und kann auf die immunologische Charakterisierung der klinischen Proben angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dies ist eine einfache, schnelle und weniger invasive Technik, die in den ambulanten Kliniken für eine relativ schnelle Immunprofile verwendet werden kann, im Gegensatz zu den herkömmlichen Techniken wie Schaben, Tupfen, Pipettieren oder Absorbieren von Filterpapier 1 , 2 . Eine Variante dieser Technik wird bereits in Forschungseinrichtungen verwendet 22 . Die künftige Anwendung der vorgeschlagenen Methodik ist die Patientenschichtung in klinischen Studien mit Augenkrankheiten, insbesondere solchen, die eine Immunophenotypisierung erfordern.
Eine große Herausforderung bei dieser Technik sind die relativ wenigen Immunzellen, die nach der Eindrucksammlung und dem Schaben wiedergewonnen wurden. Die Gesamtzahl der CD3 + T-Zellen, die aus vier Impressionen pro Individuum gewonnen wurden, variierte von ~ 500 – 1.000 Zellen. Die okulären Proben wurden vor der Durchflusszytometrieanalyse für eine minimale Anzahl von Zeiten gewaschen, um einen weiteren Verlust der Zelle zu vermeidenS. Kritische Schritte und Herausforderungen, die innerhalb des Protokolls bleiben, sind eine effiziente Sammlung von Okularproben und ein korrektes Abkratzen der Membran, um höhere Zellzahlen zu erreichen. Trotzdem ist es unwahrscheinlich, dass diese Einschränkung auf einen bestimmten Immungyp-Phänotyp hindehnt. Die hier durchgeführte Fehlersuche zur Maximierung der Ausbeute an Zellen bestand darin, die Anzahl der Waschschritte nach und vor der Inkubation von Antikörpern zu reduzieren.
Es gibt andere Einschränkungen für die Verwendung von IC. Bei Patienten mit stark verhüllter oder fibrosierter Okularoberfläche, wie im Steven-Johnson-Syndrom, kann die zelluläre Ausbeute sogar noch geringer sein als in dieser Studie. Der Anteil der Immunzellen kann sich ändern, wenn die Proben anstatt analysiert werden am selben Tag gespeichert werden. Es ist schwer vorherzusagen, ob bestimmte Zelltypen resistenter gegenüber der Lagerung sind als andere. Frühere Studien berichteten über erhöhte Spiegel der HLA-DR-Expression in den Bindehaut-Epithelzellen 23 , so dass es sich um eine Inter-Um die Korrelation zwischen HLA-DR und den Ebenen der spezifischen Immunzellen zu bewerten. Immunzellen können auch mit dem Expressionsniveau von Chemokinen assoziiert sein. Diese Fragen sollten in zukünftigen Studien behandelt werden.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Nandini Nallappan und Sharon Yeo für die Unterstützung der technischen Schritte. Die Studie wurde von einem Start-Up Grant an KGC von Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University und von einem Senior Clinician Scientist Award von der Singapore Ministerium für Gesundheit National Medical Research Council (NMRC) an LT (NMRC / CSA / 045/2012) und durch einen Zuschuss aus dem NMRC und verwaltet vom National Health Innovation Center an KGC und LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
Referências
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
