Novel analyse for Cold Nociception i<em> Drosophila</em> Larver

Drosophila har vist sig at være yderst nyttige til identifikation af hidtil ukendte konserverede gener og neuronale kredsløb, der ligger til grund kompleks adfærd. Fluer giver et sofistikeret genetisk værktøjskasse og et forenklet nervesystem, som tillader præcis genetisk og neuronal manipulation ^{1, 2, 3, 4} for at dissekere de cellulære og molekylære grundlag for nociception ^{5, 6, 7.} Larver er særligt anvendelige til disse analyser, eftersom adfærdsmæssige assays for blid berøring ^{8, 9, 10,} skadelige varme ^{11, 12, 13} og mekanisk fornemmelse af skadelige stimuli ^4, </sup> ¹¹ er allerede blevet etableret, og den gennemsigtige larver neglebånd giver mulighed for direkte eller fast billedbehandling af epidermis og underliggende sensoriske neuroner. For nylig er en analyse for skadelige koldt også blevet udviklet ^7, som vi beskriver i detaljer her.

Med en fin, konisk spids kold probe, viser vi, at Drosophila larver udviser et sæt af kolde-specifikke reaktive adfærd, adskiller sig fra adfærd observeres under normal bevægelse, efter blid berøring, eller efter barske mekanisk eller høj temperatur stimuli ^{7, 8, 11} . De kolde-specifikke adfærd omfatte et stabilt full-body kontraktion (CT), en 45-90º raise af de posteriore segmenter (PR) og en samtidig forhøje på den forreste og bageste segmenter i en U-formet (US). Udbredelsen af ​​disse adfærdsmønstre stiger med faldende temperaturer men hver toppe ved slet forskellige kolde temperaturer. Nyere arbejde foreslår, at CT responser medieret af forskellige perifere sensoriske neuroner end dem, der reagerer på skadelige varme eller barske mekanisk stimuli ^7.

Meget gerne hvirveldyr nociceptorer, Drosophila multipel dendritiske (md) perifere sensoriske neuroner har komplekse dendritiske strukturer, arborize over epidermis ^1. md neuroner er til stede i hver larve kropssegment, rager deres axoner til den ventrale nerve snor ^14. md sensoriske neuroner er adskilt i fire forskellige klasser (I-IV) baseret på dendritisk morfologi og har varierende sensoriske funktioner ^{4, 9, 10, 15, 16, 17.} Mens klasse IV neuroner er nødvendige for larvestadium lateral organ roll responserfor høje temperaturer eller barske mekaniske stimuli ^4, klasse III neuroner er nødvendige for blid berøring responser ^{9, 10} og er ikke kun aktiveres af kold, men også er nødvendige for de kolde-fremkaldte adfærdsmæssige reaktioner ^7. Både klasse III og klasse IV neuroner benytter diskrete forbigående receptor potentiale (TRP) kanaler for at lette adfærdsmæssige reaktioner på skadelige ^{7, 11, 18} og ikke-skadelige stimuli ^{9, 10, 17, 19.} Endvidere er larvernes nociception sensibiliseret følgende skade, på cellulært ²⁰ og adfærdsmæssige niveau ^{12, 21.}

Den her beskrevne assay muliggør quantification af enten normalt, eller potentielt ændret adfærdsmæssige reaktioner på kolde temperaturer fra skadelige kold (≤ 10 ºC), uskadelig cool (11-17 ºC), til omgivelsestemperaturer (18-22 ºC). De kolde temperaturer, der anvendes i dette assay er i stand til direkte at aktivere klasse III sensoriske neuroner, fremkalde robuste, reproducerbare calcium stiger og kolde fremkaldte adfærdsmæssige reaktioner, som kan være kvalitativt og kvantitativt analyseret ^7. Dette assay kan anvendes til larver af stort set enhver genotype samt larver udsat for forskellige miljømæssige betingelser (ændret ernæring, skade, farmakologiske midler) for at bestemme både genetiske og miljømæssige faktorer, der påvirker kold nociception, nociceptive sensibilisering eller nociceptive plasticitet. Eftersom thermosensation er allestedsnærværende på tværs af mange arter, dette assay tilvejebringer et værdifuldt redskab til studiet af nociception og kan afdække hidtil ukendte gen-mål eller neuronale interaktioner, der vil forbedrevores forståelse af hvirveldyr nociception.

Specialbyggede kold probe (se kold probe, tabel of Materials) anvender en lukket sløjfe temperaturreguleret Peltier anordning, som køler aluminium skaft og konisk spids gennem termisk ledning. En termistor er indlejret inde i aluminium koniske spids rapporterer realtid temperatur på styreenheden. En kølepladen og blæseren er fastgjort til det termoelektriske modul til at regulere Peltier effektens varmebelastning (Qc), så den ønskede temperaturområde på (22-0 ° C) kan opnås (se Thermal Control Unit, tabel of Materials). Den skadelige kolde stimulus fra den kolde sondespidsen påføres med hånden for at den dorsale midtlinie, til segment (er) lige langt fra anteriore og posteriore ender (groft segment A4, se figur 1A) af larve. Som reaktion på kolde stimuli, larver generelt fremstilling af en af ​​tre kold fremkaldt adfærd inden for en 10 s cutoff: en fuld legemekontraktion (CT), en 45-90º raise på forreste og bageste segmenter til en U-formet (US), eller en stigning på de posteriore segmenter (PR) (beskrevet i Resultater). Ingen af ​​disse adfærdsmønstre udføres under normal peristaltisk bevægelse eller fourageringsadfærd. Disse adfærdsmønstre er også forskellige fra blid berøring responser og den aversive rullende respons på høj temperatur eller skadelige mekaniske stimuli.