Новый анализ для холодной ноцицепции в<em> Drosophila</em> личинки
Summary
Здесь мы демонстрируем новый анализ для изучения холодной ноцицепции у личинок дрозофилы. Этот тест использует пользовательский встроенный Пельтье зонд, способный прикладывать фокусный вредный холодный стимул и приводит к количественному холодных конкретному поведению. Эта методика позволит дальнейшему клеточному и молекулярному рассечение холодной ноцицепции.
Abstract
Как организмы чувствуют и реагируют на вредные температуры до сих пор плохо изучены. Кроме того, механизмы, лежащие в основе сенсибилизации сенсорной техники, такие, как у пациентов, испытывающих периферической невропатии или травмы, вызванной сенсибилизацию, не очень хорошо охарактеризованы. Генетически послушная модель дрозофилы была использована для изучения клетки и генов , необходимую для обнаружения вредного тепла, которая давала несколько консервативных генов, представляющих интерес. Мало что известно, однако, о клетках и рецепторах, важных для вредного холодного зондирования. Хотя, Drosophila не выдерживает длительное воздействие низких температур (≤10 ° C), и позволит избежать прохладно, предпочитая более теплые температуры в поведенческих предпочтений анализов, как они чувствуют , и , возможно , избежать вредных холодных раздражители только недавно были исследованы.
Здесь мы описываем и охарактеризовать первый вредный холод (≤10 ºC) поведенческий анализ вDrosophila. С помощью этого инструмента и анализа, мы покажем, следователь, как качественно, так и количественно оценить холодные ноцицептивных поведения. Это может быть сделано при нормальных / здоровых условий культивирования, или предположительно в контексте заболевания, травмы или сенсибилизации. Кроме того, этот анализ может быть применен к личинкам, выбранному для желательных генотипов, которые могли бы повлиять на thermosensation, боль или ноцицептивную сенсибилизацию. Учитывая, что боль является высоко консервативен процессом, с помощью этого анализа для дальнейшего изучения тепловой ноцицепции, вероятно, почерпнуть важное понимание болевых процессов у других видов, в том числе позвоночных.
Introduction
Дрозофилы, оказались весьма полезными для идентификации новых генов сохраняются и нейронных цепей , которые лежат в основе сложного поведения. Мухи обеспечивают сложный генетический инструментарий и упрощенную нервную систему , которая позволяет точно и генетической манипуляции нейрональной 1, 2, 3, 4 рассекать клеточные и молекулярные основы ноцицепции 5, 6, 7. Личинки являются особенно полезными для этих анализов, учитывая , что поведенческие анализы для нежного прикосновения 8, 9, 10, Вредное теплом 11, 12, 13 и механического ощущения вредных раздражителей 4, </sup> 11 уже установлены, и прозрачная личиночная кутикула позволяет живому или фиксированное изображение эпидермиса и лежащих в основе сенсорных нейронов. В последнее время анализ на вредный холод также был разработан 7, который мы опишем более подробно здесь.
Использование тонкого, конический наконечником холодного зонда, мы показали , что личинки дрозофил демонстрируют множество холодного специфического реакционноспособного поведения, отличное от поведения , наблюдаемого при нормальной локомоции, после нежного прикосновения, или после жесткой механической или высокой температуры раздражители 7, 8, 11 , Холодное конкретное поведение включает в себя надежное сокращение всего тела (СТ), а 45-90º повышение сегментов задних (PR) и одновременного повышение переднего и задних сегменты в U-образную форму (США). Распространенность такого поведения возрастает с понижением температуры, но каждый с пиками прислегка различные низкие температуры. Последние работы показывают , что ответы CT опосредованы различными периферическими сенсорными нейронами , чем те , которые реагируют на вредное тепло или жесткие механических раздражители 7.
Так же, как позвоночный ноцицепторов, дрозофила множественный дендритный (мД) периферические сенсорные нейроны имеют сложные дендритные структуры , которые ветвятся над эпидермисом 1. MD нейроны присутствуют в каждом сегменте тела личинок, проецируют свои аксоны в брюшной нервной цепочки 14. MD сенсорные нейроны разделяются на четыре различных классов (I-IV) , основанных на дендритной морфологии и имеют различные сенсорные функции 4, 9, 10, 15, 16, 17. В то время как класс IV нейроны необходимы для личиночных ответов рулонных бокового телавоздействию высоких температур или жестких механических раздражителей 4, класс III нейронов необходимы для нежного прикосновения ответов 9, 10 и не активируются только холодным, но и необходимы для холодных-вызванного поведенческих реакций 7. Оба класса III и класса IV нейроны используют дискретные потенциальные каналы переходных рецепторов (ГТО) , чтобы облегчить поведенческие реакции на вредные 7, 11, 18 и безвредными стимулы 9, 10, 17, 19. Кроме того, личиночная ноцицепция сенсибилизирует после травмы, на клеточные 20 и поведенческих уровнях 12, 21.
Анализ, описанный здесь, позволяет quantificatioп либо нормальные, или потенциально изменены поведенческие реакции низких температур в диапазоне от вредного холодного (≤ 10 ° С), безвредным прохладным (11-17 ° C), до температуры окружающей среды (18-22 ° C). Холодные температуры , используемые в данном анализе способны непосредственно активации класса III сенсорных нейронов, вызывая надежное и воспроизводимое увеличение кальция и холодное вызывало поведенческие реакции, которые могут быть качественно и количественно анализировало 7. Этот анализ может быть применен к личинкам практически любому генотипа, а также личинки подвергается воздействию различных условий окружающей среды (измененном питания, травмы, фармакологические агенты), чтобы определить, как генетические и экологические факторы, которые влияют на холодные ноцицепции, ноцицептивную сенсибилизацию или ноцицептивную пластичность. Принимая во внимание, что thermosensation повсеместно во многих видах, этот анализ представляет собой ценный инструмент для исследования ноцицепции и может раскрыть новые цели генов или нервные взаимодействия, которые улучшатнаше понимание позвоночной ноцицепции.
На заказ встроенные холодный зонд (см холодного зонда, таблица материалов) использует замкнутую петлю температуру контролируемой Пельтие устройство, которое охлаждает алюминиевый вал и конический конец через теплопроводность. Термистор встроен внутри наконечника конического алюминия сообщает температуру в режиме реального времени на блоке управления. Радиатор и вентилятор прикреплены к термоэлектрическим модулем для регулирования может быть достигнут эффект Пельтье в тепловой нагрузки (Qc) , так что желаемый температурный диапазон (22-0 ° C) (см Тепловой блок управления, таблицу материалов). Вредный холодный стимул холодного наконечника зонда наносится вручную к средней линии спины, чтобы сегмент (ы) , равноудаленной от переднего и заднего концов (примерно сегмента А4, см Фигура 1А) личинки. В ответ на холодные раздражители, личинки обычно производят один из трех холоднокатаных вызванного поведения в течение 10 с отсечки: полное телосокращение (КГ), 45-90º подъем передних и задних сегментов в U-образную форму (США), или повышение сегментов задних (PR) (описанных в результатах). Ни один из этих поведений не выполняются во время нормальной перистальтической локомоции или нагула поведения. Такое поведение также отличается от нежных сенсорных реакций и аверсивной прокатки ответа на высокую температуру или вредные механические стимулы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ, описанный здесь, может быть использован для качественно и количественно оценить ноцицепции или ноцицептивную сенсибилизацию у личинок различных генетических фонов, воздействий окружающей среды, и / или повреждений индуцированных условий. Так как этот анализ позволяет фокаль?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сару В и Камил Грейам для разработки ранних этапов анализа холодного зонда, в Блумингтоне дрозофила фондового центра для акций мух и членов лаборатории Галько~d для критически чтения рукописи. Эта работа была поддержана NIH НРС (NIH F31NS083306) в HNT, и NIH R01NS069828, R21NS087360 и Техасский университет MD Anderson Clark Fellowship в фундаментальных исследованиях до MJG.
Materials
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | |
| 60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
Referências
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move – Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
