哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析

細胞レベルでの宿主 – 病原体相互作用の可視化は、病原性戦略への洞察を獲得し、主要な細胞経路を同定するための強力な方法である。事実、病原体は、自身の生存または増殖のための戦略として中央細胞プロセスを破壊するように進化しているので、病原体を重要な細胞標的または構造を特定するためのツールとして使用することができる。細胞成分の可視化は、蛍光標識された宿主タンパク質を組換え発現することによって達成することができる。これはリアルタイム分析を可能にするが、特異的に標識された宿主タンパク質を有する細胞株の生成は非常に面倒であり、望ましくない副作用をもたらし得る。複数の宿主因子を同時に分析することができ、特定の細胞型に限定されないため、特異的抗体を用いた細胞因子の検出がより便利である。欠点は、免疫蛍光分析が宿主細胞固定化を必要とするので、静的視野のみを捕捉できることであるイオン。しかしながら、免疫蛍光イメージングの重要な利点は、それが定性分析および定量分析の両方に容易に役立つことである。これは、次に、宿主 – 病原体相互作用への新しい洞察を提供するために統計的に有意な差異を得るために使用することができる。

蛍光画像解析プログラムは、3Dおよび4D解析を実行するための強力な解析ツールです。しかし、ソフトウェアの高コストとそのメンテナンスは、フリー・オープンソース・ソフトウェアに基づく方法をより広く魅力的にしています。バイオ分析ソフトウェアを使用した慎重な画像分析は、視覚分析を実証し、統計的有意性を割り当てるときに、所与の表現型の正確性に対する信頼性を高めるので有益である。これまで、SGは、個別のSG ^4の手動識別を必要とする無料のImageJソフトウェアを使用して分析されていました。ここでは、bacの文脈における細胞SG形成の誘導および分析のためのプロトコルを提供するフリーオープンソースのバイオイメージ分析ソフトウェアICY（http://icy.bioimageanalysis.org）を使用して、腸内感染を検出した。バイオイメージ解析ソフトウェアには、SG解析に非常に適したスポット検出プログラムが組み込まれています。これにより、指定された関心領域（ROI）での自動検出プロセスの微調整が可能になります。これは、個々のSGの手動分析の必要性を克服し、サンプリングバイアスを除去する。

多くの環境ストレスは、直径0.2-5μmの相密度の高いサイトゾル、非膜構造であるSGの形成を誘発する^5,6 。この細胞応答は、酵母、植物および哺乳動物において進化的に保存され、全身タンパク質翻訳が阻害される場合に起こる。これは、失活した翻訳開始複合体のSGへの凝集を含み、翻訳的に不活性なmRNAの保持場所と考えられ、細胞mRNAのサブセットの選択的翻訳を可能にする。ストレスを除去すると、SGが溶解し、タンパク質合成の全体的な速度が再開する。 SGは、翻訳伸長開始因子、RNA代謝に関与するタンパク質、RNA結合タンパク質、ならびに宿主細胞シグナリング^2に関与するスカフォールドタンパク質および因子からなるが、正確な組成は適用されるストレスに依存して変化し得る。 SG形成を誘発する環境因子には、アミノ酸飢餓、UV照射、熱ショック、浸透圧ショック、小胞体ストレス、低酸素症およびウイルス感染が含まれる2,7,8。ウイルスがどのように誘導され、SGの形成を破壊するかについての理解が進んだが、細菌、真菌、原生動物病原体などの他の病原体がこの細胞ストレス応答にどのように影響するかについてはほとんど知られていない。

シゲIIフレクスナーは、ヒトのグラム陰性通性細胞質ゾル病原体であり、重度の下痢またはシゲラ症の原因物質である。シゲロシスは重大な公衆衛生上の負担であり、5歳未満の小児では毎年28,000人の死亡を引き起こす。 フレックスネリは結腸上皮に感染し、宿主の細胞骨格成分^11,12をハイジャックすることにより細胞間拡散を起こす 。上皮の感染は、サイトゾル内でのフレクスネリ（ flexneri）の複製を支持するが、感染マクロファージは、熱中症と呼ばれる炎症性細胞死プロセスによって死ぬ。感染は、熱、酸化ストレスおよび組織破壊を伴う好中球および重度の炎症の大規模な動員につながる。したがって、感染細胞は、ゴルジ破壊、遺伝毒性ストレスおよび細胞骨格再編成などの感染によって誘導される内部ストレスを受ける炎症過程に起因する環境ストレスにさらされる。

多数のSGマーカーを用いて環境ストレスに応答する細胞の能力に対するS.フレックスネリ感染の特徴付けは、感染がSG組成^3の定性的および定量的差異をもたらすことを実証した。しかしながら、他の細菌病原体についてはほとんど知られていない。ここでは、異なる環境ストレスを有する細胞のストレス、SG成分の標識、および感染の文脈におけるSGの形成および組成の定性的および定量的分析を含む、細胞質病原菌S.フレックスネリによる宿主細胞の感染のための方法論を説明する。および非感染細胞が含まれる。この方法は、他の細菌病原体に広く適用可能である。さらに、SG形成の画像分析は、ウイルスまたは他の病原体による感染のために使用され得る。それはSGを分析するために使用することができます外因性のストレスに応答したSG形成に対する感染の影響または感染の効果。