哺乳动物细胞细菌挑战后应激颗粒形成的免疫荧光分析

在细胞水平上可视化宿主 – 病原体相互作用是获得对致病性策略和识别关键细胞途径的见解的有力方法。事实上，病原体可以用作确定重要细胞靶点或结构的工具，因为病原体已经发展为颠覆中枢细胞过程，作为其自身存活或繁殖的策略。可以通过重组表达荧光标记的宿主蛋白来实现细胞成分的可视化。虽然这允许进行实时分析，但具有特异标记宿主蛋白质的细胞系的产生是非常费力的并且可能导致不期望的副作用。使用特异性抗体检测细胞因子更方便，因为可以同时分析多个宿主因子，并且不限于特定的细胞类型。缺点是只有静态视图可以被捕获，因为免疫荧光分析需要宿主细胞修复离子。然而，免疫荧光成像的一个重要优点是其易于定性和定量分析。这又可用于获得统计学显着的差异，以提供对宿主 – 病原体相互作用的新见解。

荧光图像分析程序是执行3D和4D分析的强大的分析工具。然而，软件及其维护成本高昂使得基于免费开源软件的方法更具吸引力。使用生物分析软件的仔细图像分析是有价值的，因为它证实了视觉分析，并且在分配统计学意义时，增加了给定表型的正确性的置信度。以前，使用免费的ImageJ软件分析SG，这需要手动识别个人SG ⁴ 。在这里，我们提供了一个在细菌SG形成诱导和分析方案使用免费的开源生物图像分析软件ICY（http://icy.bioimageanalysis.org）进行真实感染。生物图像分析软件具有高度适用于SG分析的内置点检测程序。它允许在指定的感兴趣区域（ROI）中对自动检测过程进行微调。这克服了对个别SG的手动分析的需要，并消除了抽样偏差。

许多环境胁迫引起SGs的形成，SG是直径为⁵ – 6μm的相间致密的胞质结构，非膜结构为0.2-5μm。这种细胞反应在酵母，植物和哺乳动物中进化上保守，并且当全球蛋白质翻译被抑制时发生。它涉及停滞的翻译起始复合物聚集到SG中，其被认为是用于翻译失活的mRNA的保留位置，允许细胞mRNA的子集的选择性翻译。消除压力后，SGs溶解，蛋白质合成的全球速率恢复。 SG由翻译延伸起始因子，涉及RNA代谢的蛋白质，RNA结合蛋白质以及支架蛋白质和参与宿主细胞信号传导的因子^2组成 ，尽管精确的组成可以根据施加的应力而变化。诱导SG形成的环境因素包括氨基酸饥饿，紫外线照射，热休克，渗透压休克，内质网应激，缺氧和病毒感染^2,7,8 。在理解病毒如何诱导和颠覆SG形成方面取得了许多进展，而关于其他病原体（如细菌，真菌或原生动物病原体）如何影响细胞应激反应^1,7尚不清楚。

师哥lla flexneri是人类的革兰氏阴性兼性细胞溶质病原体和严重腹泻或志贺氏菌病的致病因子。志贺氏菌病是一个主要的公共卫生负担，每年导致5岁至⁹岁的儿童死亡28 000人。 S. flexneri感染结肠上皮，并通过劫持宿主的细胞骨架成分^11,12扩散细胞对细胞。上皮细胞的感染支持了胞内溶胶酶的复制，但被感染的巨噬细胞通过炎性细胞死亡过程称为焦灼死亡。感染导致大量招募中性粒细胞和严重的炎症，伴随着热，氧化应激和组织破坏。因此，虽然被感染的细胞受到感染引起的内部应激，例如高尔基体破坏，遗传毒性应激和细胞骨架重排感染细胞也由于炎症过程而受到环境压力。

使用许多SG标记物表征S. flexneri感染对细胞对环境胁迫反应能力的影响已经证明，感染导致SG组成^3的定性和定量差异。然而，其他细菌病原体知之甚少。在这里，我们描述了一种感染宿主细胞与细胞溶质病原体S. flexneri ，不同环境胁迫的细胞的应激，SG组分的标记，以及感染SG的形成和组成的定性和定量分析的方法和非感染细胞。该方法广泛适用于其他细菌病原体。此外，SG形成的图像分析可以用于病毒或其他病原体的感染。可用于分析SG感染后的形成或感染对SG形成的影响以响应外源性应激。