Beskrevet her er en iscenesat, adfærdsmæssig screening tilgang, som kan bruges til at screene for forbindelser, der udviser in vivo effektivitet på kognitive og funktionelle motoriske adfærd i transgene musemodeller af β-amyloidose og tauopati. Disse metoder er optimeret til at skærmforbindelser til aktivitet i kort- og arbejdsminneopgaver.
Her beskriver vi en trinvis, adfærdsmæssig testmetode, som kan bruges til at screene for forbindelser, der udviser in vivo- effekt på kognitive og funktionelle motoriske adfærd i transgene musemodeller af β-amyloidose og tauopati. Paradigmet indbefatter test for spontan veksling i en Y-labyrint, ny genkendelse af genstande og leddklamring. Disse tests blev valgt fordi de: 1) forhører funktionen af kognitive eller motoriske domæner og det korrelerede neurale kredsløb, der er relevant for den humane sygdomstilstand, 2) har klart definerede endepunkter, 3) har let implementerbare kvalitetskontrolkontroller 4) kan køres i Et moderat gennemløbsformat, og 5) kræver en lille indsats fra efterforskeren. Disse metoder er designet til forskere, der søger at skærmforbindelser til aktivitet i kort- og arbejdsminneopgaver eller funktionelle motoriske adfærd i forbindelse med Alzheimers sygdomsmusimodeller. De metoder, der beskrives her, bruger adfærdstest, som engAlder en række forskellige hjerneområder, herunder hippocampus og forskellige kortikale områder. Undersøgere, der ønsker kognitive tests, der specifikt vurderer kognition medieret af en enkelt hjerneområde, kunne bruge disse teknikker til at supplere andre adfærdstest.
Alzheimers sygdom (AD) er en progressiv neurodegenerativ lidelse, der resulterer i svækkende kognitive tilbagegang, der rammer ca. 44 millioner mennesker over hele verden. I øjeblikket er der ingen tilgængelige behandlinger for AD, der er sygdomsmodificerende, understreger det presserende behov for præklinisk opdagelse af nye terapeutiske strategier for denne sygdom. Der er blevet skabt en række forskellige transgene musemodeller, der rekapitulerer forskellige aspekter af AD 1 , 2 , herunder underskud i kognitive domæner forstyrret hos patienter 3 . Disse musemodeller repræsenterer et nyttigt værktøj til at lette effektiv screening in vivo .
Ved vurdering af en forbindelse for potentiel in vivo- effektivitet skal der træffes en trinvis tilgang, der skærmbilleder for effektivitet i passende kognitive domæner og overvåger også adfærd, som kunne påvirke de specifikke endepunkter, der anvendes til enSsess cognition. Mange transgene musemodeller af AD udviser hyperaktivitet og andre adfærd, som kan interferere med en bestemt kognitiv test og forbyde dets anvendelse ved lægemiddel screening 4 . For at en tilgang skal kunne gennemføres i et lægemiddel screeningsmiljø, bør de særlige tests, der anvendes, i det mindste have en moderat gennemgang, have klart definerede endepunkter og en procedure, der kræver minimal indgriben fra efterforskerne. Ved anvendelse af disse kriterier kan adfærdsmæssige skærmbilleder implementeres, som udviser reproducerbarhed, lav intra- og interassay variance og effektstørrelser, der er nødvendige for sammensatte screening. Detaljeret her er de metoder, vi har anvendt til at screene for forbindelser, der er effektive til at mildne de kognitive og motoriske fænotyper, der er til stede i transgene musemodeller af β-amyloidose og tauopati 5 , 6 . De beskrevne metoder er tilpasset fra almindeligt anvendte adfærdsmæssige paradigmer, der er rapporteret i lIteratur 7 med specifikke optimeringer og kontrol af kvalitetskontrol, så de kan anvendes i transgene musemodeller, der er relevante for AD. Denne protokol kan bruges sammen med en lang række dataindsamlings- og analysesystemer og antager, at efterforskeren har et kendskab til den tilknyttede software.
Betydningen af teknikken med respekt for eksisterende metoder
Denne procedure er designet til at screene for in vivo- aktivitet af forbindelser i transgene musemodeller af p-amyloidose og tauopati. Den benyttede fremgangsmåde anvendt her sikrer påvisning af effektive forbindelser i kognitive domæner, der er relevante for AD 3 . Desuden bruger den tilgang, der er beskrevet her, adfærdstests, der har klart definerede endepunkter, let implementerbare kvalitetskontrolkontroller, kan køres i et moderat gennemløbsformat og kræver lidt intervention fra efterforskeren. Disse egenskaber resulterer i analyser, der udviser god reproducerbarhed hos dyr og tværs af kohorter, hvilket resulterer i lave intra- og interassay varians og effektstørrelser (2 ≤ f ≤ 6), som er robuste nok til at understøtte adfærdsmæssig profilering i et lægemiddelopdagelsesmiljø.
Kritiske trin inden for Protocol
Mange musemodeller til brug for AD-lægemiddelforskning udviser adfærd i overensstemmelse med øget angst og aggression. Dette gør håndteringshabituation afgørende for at udføre nogen af de adfærdstest, der beskrives her. Da disse test er afhængige af umotiveret adfærd, kan en grov behandling af efterforskeren på grund af en hyperaktiv og angst eller aggressiv mus betydeligt påvirke ydeevnen. Højere angst kan resultere i manglende udførelse af opgaven, hvilket reducerer testets samlede effekt. Desuden er lysniveauer i arenaen afgørende for at lette den spontane bevægelse, der er nødvendig for hver test. Lyst lys har tendens til at øge angst og undertrykke fremdrift i gnavere, derfor bør man sørge for at justere omgivende lysniveauer til 30-35 lux i arenaen.
Et andet kritisk aspekt af proceduren er minimering af stærke miljøindikatorer, der ville forstyrre et dyrs evne til at udføre opgaverne. Rengøring afArena og genstande mellem kørsler er afgørende, da mus er tiltrukket af nye dufte i miljøet. Manglende grundig rengøring af arenaen og genstande kan resultere i kvældende spontan aktivitet af musen og maskering af ægte kognitiv ydeevne. Undersøgere bør også minimere brugen af personlige hygiejneprodukter og colognes / parfumer, når de udfører disse procedurer. Endelig udviser gnagere robuste daglige og cirkadiske ændringer i mange åbenlyse adfærd 20 herunder læring og hukommelse 21 . For at minimere varians på grund af daglige rytmer i basal adfærd og kognitiv ydeevne, bør alle forsøg udføres på samme tid på dagen på tværs af kohorter og undersøgelser.
Yderligere specifikt med hensyn til ny genkendelse af genstand er forsinkelsesintervallet mellem prøve og testfase og udvælgelse og placering af objekter i miljøet kritiske parametre. Hukommelsen findes i 3 forskellige former: kort sigt memOry (STM), mellemliggende sigtminne (ITM) og langtidshukommelse (LTM) 22 , 23 . Ændring af intervallet mellem prøve og testfaser fra minutter (STM) til timer (ITM) eller dage (LTM) ændrer den type hukommelse, der testes ved proceduren 12 . Desuden bør mange genstande screenes i en testkohort af mus for potentielle forstyrrelser ved udforskning inden kørsel af den nye genstandsgenkendelsestest. Et objekt, der er overdrevent attraktivt eller afstødende for testkohorten, kan ikke bruges ved vurdering af ny genkendelse af genstande. Ideelt vil alle objekter, der vil blive anvendt i testen, placeres i en arena, fremkalde lige efterforskningstider fra en naiv kohort af mus. Utilstrækkelig test og optimering af objekter kan betydeligt reducere kraften i ny genkendelse af genstande.
Ændringer og fejlfinding
Der er flere faktorer, der kan øgeTilsyneladende variabilitet i de kognitive tests, der er beskrevet her. Mange musemodeller af AD udviser hyperdynamisk bevægelse 3, som kan maske eller ændre adfærd målt som det kognitive endepunkt. Derudover er der voksende tegn på, at køn 24 , 25 , 26 og endda moral genotype 27 kan påvirke udvikling og progression af neuropatologi og kognitive fænotyper i AD musemodeller. Uventet variabilitet eller manglende gennemførelse af adfærdsmæssige opgaver kan skyldes nogen af disse faktorer. Når man først gennemfører en bestemt adfærdstest, skal resultaterne altid stratificeres efter køn, alder og, hvis det er relevant, moderens genotype. Endvidere skal de kvalitetskontroller, der skitseres i denne procedure, altid udføres for at sikre, at hyperaktivitet eller anden stereotyp adfærd ikke forstyrrer kvantificering af kognitive endepunkter.
konvolutStrygning kan også påvirke spontane udforskende opførsel af gnavere. Dufte eller lyde, der ikke kan påvises for forskere, kan tiltrække eller afvise mus, skevende resultater af kognitive tests, som er afhængige af spontan adfærd. Når man i første omgang etablerer Y-labyrint eller ny genkendelse af genstand, er det afgørende at udføre kontrolforanstaltningerne for at sikre, at der ikke er positionelle forstyrrelser ved udforskning af genstande og / eller miljø. Hvis der observeres positionelle forstyrrelser, skal forskerne grundigt undersøge miljøet og potentielt justere belysning, arena placering, placering af testrum i forhold til andre rum i anlægget ( dvs. ikke nær et højt trafikområde eller tungt udstyr) og arenarensningsprocedurer.
Habituation til testmiljøet er nøglen til opnåelse af optimal ydeevne i den nye genkendelsesprøve. For eksempel kan lave samlede udforskningstider skyldes utilstrækkelig habituation. Som et alternativ til procUdgaver der skitseres her for håndtering (afsnit 2) og arena (afsnit 4.2) tilpasning, behandling til håndtering og testmiljøet kan udføres som 3, 5 min sessioner om dagen i 2 på hinanden følgende dage.
Begrænsninger af teknikken
Som ved enhver procedure har disse adfærdsmæssige test begrænsninger. Disse procedurer er blevet anvendt, fordi de tester funktionen af forskellige kortikale regioner og hippocampus. Hvis musemodellen ikke udviser funktionelle underskud i hjernegrupper probed af disse tests, vil disse teknikker ikke være nyttige. Desuden har vi valgt kognitive tests, der sondrer korttidshukommelse. Hvis virkningsmekanismen for forbindelsen under præklinisk vurdering ikke forventes at påvirke korttidshukommelsen, skal disse procedurer ændres i overensstemmelse hermed ( dvs. øge prøve-testfaseintervallet for at teste langvarig hukommelse). Endelig bruger disse tests umotiverede adfærd. Derfor, hvis en musemodel er excesSively hyperaktiv eller viser andre stereotype adfærd, der forhindrer efterforskning af miljøet, er disse procedurer måske ikke optimalt. Som et alternativ kunne man bruge frygtkonditionering til Tg2576 eller andre β-amyloidose-musemodeller eller den rumlige vandlabyrette til rTg4510 eller andre musemodeller af tauopati 3 .
Fremtidige applikationer
Når disse procedurer er blevet godkendt i laboratoriet, kan der foretages adskillige modifikationer eller forlængelser for at vurdere yderligere kognitive og funktionelle motoriske foranstaltninger. For eksempel kan du ændre den nye objektgenkendelsesopgave for at bestemme, om en mus kan genkende en ændring i placeringen af et objekt 13 . Alternativt kan man i stedet for at bruge objekter bruge andre mus og gennemføre en test af social anerkendelse. Med hensyn til lemmer og motorfunktion kan man supplere denne test med ledningshængden og / eller grebstyrketesten. TesteneDetaljeret i denne fremgangsmåde danner en fast base til screening for forbindelser, der har in vivo- effektivitet i translationelle musemodeller for AD og kan tilpasses eller modificeres på mange måder for bedst at forhøre en bestemt musemodel eller opfylde behovene hos et unikt lægemiddelopdagelsesprogram .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |