ここでは、βアミロイドーシスおよびタウオパチーのトランスジェニックマウスモデルにおける認知および機能的運動行動に対するインビボでの有効性を示す化合物をスクリーニングするために用いることができる、段階的な行動スクリーニングアプローチを記載する。これらの方法は、短期および作業記憶課題における活性について化合物をスクリーニングするために最適化される。
ここでは、βアミロイドーシスおよびタウオパチーのトランスジェニックマウスモデルにおける認知機能運動行動に対するインビボの有効性を示す化合物をスクリーニングするために用いることができる段階的な行動試験アプローチについて説明する。このパラダイムには、Y字型迷路における自発的な交替、新規な物体認識、四肢の挟み込みのテストが含まれる。これらの試験は、1)認知領域または運動領域の機能、およびヒト疾患状態に関連する相関神経回路の機能、2)エンドポイントの明確な定義、3)容易に実行可能な品質管理チェックの実行、4)適度なスループットフォーマット、および5)研究者の介入はほとんど必要ない。これらの方法は、アルツハイマー病マウスモデルに関連する短期記憶および作業記憶課題、または機能的運動行動における化合物のスクリーニングを検討する研究者のために設計されている。ここで説明するメソッドは、eng海馬および種々の皮質領域を含む多数の異なる脳領域を年齢に合わせる。単一の脳領域によって媒介される認知を特異的に評価する認知試験を望む研究者は、これらの技術を用いて他の行動試験を補うことができる。
アルツハイマー病(AD)は、進行性の神経変性疾患であり、世界中で約4400万人の人々に影響を与える衰弱性の認知低下をもたらす。現在、この疾患に対する新規治療戦略の前臨床発見の緊急の必要性を強調して、疾患修飾性であるADに対する利用可能な治療法はない。 AD1,2の様々な局面を要約する多数の異なるトランスジェニックマウスモデルが作成され、患者3において中断された認知領域の欠損を含む。これらのマウスモデルは、インビボでの効率的なスクリーニングを促進するための有用なツールである。
潜在的インビボ有効性について化合物を評価する場合、適切な認知領域における有効性をスクリーニングする段階的アプローチが行われなければならず、また、特定のエンドポイントに影響を及ぼす可能性のある行動ssess認知。 ADの多くのトランスジェニックマウスモデルは、多動性および特定の認知試験を妨害する可能性のある他の行動を示し、薬物スクリーニングでのその使用を禁止する4 。さらに、薬物スクリーニング環境で実施されるアプローチのために、使用される特定の試験は、少なくとも適度なスループットを維持し、明確に定義されたエンドポイントを有し、治験責任医師の介入を最小限に抑える手順をとるべきである。これらの基準を使用して、化合物スクリーニングに必要な再現性の低い、アッセイ間およびアッセイ間の差異および効果サイズを示す行動スクリーンを実施することができる。ここでは、βアミロイドーシスおよびタウオパチーのトランスジェニックマウスモデルに存在する認知および運動表現型を緩和するのに有効な化合物をスクリーニングするために使用した方法を詳述する5,6。記述された方法は、lで報告された一般的に使用される行動パラダイムADに関連するトランスジェニックマウスモデルにおいて使用され得るように、特定の最適化および品質管理チェックを伴う、反復7 。このプロトコルは、様々なデータ収集および分析システムと共に使用することができ、研究者が関連するソフトウェアの実際の知識を持っていることを前提としています。
既存の方法に関する技術の意義
この手順は、β-アミロイドーシスおよびタウオパチーのトランスジェニックマウスモデルにおける化合物のインビボ活性をスクリーニングするために設計されている。ここで用いられる段階的アプローチは、AD 3に関連する認知領域における有効な化合物の検出を確実にする。さらに、ここで詳述するアプローチでは、エンドポイントが明確に定義されたビヘイビアテスト、実装が容易な品質管理チェック、中程度のスループット形式での実行が可能であり、調査者の介入もほとんど必要ありません。これらの特徴は、動物内およびコホート間で良好な再現性を示すアッセイをもたらし、薬物発見環境における行動プロファイリングをサポートするのに十分な堅牢性を有するアッセイ間およびアッセイ間の分散および効果サイズ(2≦ f ≦6)
Prの重要なステップオトコ
AD薬物探索に使用される多くのマウスモデルは、不安と攻撃性の高まりと一致する行動を示す。これにより、ここで説明されている行動テストの実行に必要な習慣化の手がかりが得られます。これらのテストは運動不能な行動に依存しているので、過度に不安定で不安で攻撃的なマウスによる研究者の扱いの乱れは、パフォーマンスに大きな影響を与える可能性があります。不安が高まると、タスクを実行できなくなり、テスト全体の能力が低下する可能性があります。さらに、アリーナの光レベルは、各試験に必要な自発的な運動を促進するために不可欠である。明るい光は不安を増し、げっ歯類の移動を抑制する傾向があるため、周囲の光レベルをアリーナで30〜35ルクスに調整するように注意する必要があります。
この手順のもう1つの重要な側面は、タスクを実行する動物の能力を妨げる強力な環境的合図の最小化である。その清掃マウスが環境中の新しい香りに引き寄せられるので、競技場と競技場の間の競技場は必須である。アリーナと物体を完全にきれいに掃除しないと、マウスの自発的な活動が歪められ、真の認知能力がマスキングされる可能性がある。調査官は、これらの手技を行う際には、個人用衛生用品およびコロン/香水の使用も最小限にすべきである。最後に、齧歯類は、学習や記憶を含む多くの明白な行動20において昼間と日常の強い変化を示す。したがって、基礎行動および認知能力の日内リズムによる変動を最小限に抑えるために、すべての試験は、コホートおよび研究を通して同一の時刻に行うべきである。
さらに、新規物体認識に関しては、試料と試験フェーズとの間の遅延間隔、および環境中の物体の選択および配置が重要なパラメータである。記憶は3つの異なる形態で存在する:短期memオーリー(STM)、中間期記憶(ITM)および長期記憶(LTM) 22,23を含む 。サンプルフェーズとテストフェーズの間隔を分(STM)から時間(ITM)または日(LTM)に変更すると、手順12でテストされたメモリのタイプが変更されます。さらに、新規物体認識試験を実施する前に、探索の潜在的な偏りについて、多くの物体をマウスの試験コホートでスクリーニングすべきである。テストコホートに対して過度に魅力的または反発的な対象物は、新規対象認識を評価する際に使用することができない。理想的には、テストに使用されるすべてのオブジェクトがアリーナに配置されると、ナイーブなコホートのマウスから等しい探索時間が引き出されます。オブジェクトの不十分なテストおよび最適化は、新規オブジェクト認識の能力を著しく低下させる可能性がある。
変更とトラブルシューティング
このような要素を増やすにはいくつかの要因があります。ここに記載されている認知テストの見かけの変動性。 ADの多くのマウスモデルは、認知エンドポイントとして測定された行動をマスクしたり、変更したりすることができる、高力学的な運動3を示す。さらに、セックス24,25,26 、さらには母系遺伝子型27でも、ADマウスモデルにおける神経病理学および認知表現型の発達および進行に影響を与えうるという証拠が増えている。予期せぬ変動または行動課題の実施の失敗は、これらの要因のいずれかに起因する可能性があります。最初に特定の行動テストを実施する場合、結果は常に性別、年齢、および該当する場合、母親の遺伝子型によって層別化されるべきである。さらに、この手順で概説されている品質チェックは、機能亢進または他の常同行動が認知エンドポイントの定量化を妨げていないことを確実にするために常に実行されるべきである。
環境アイロンメントは、げっ歯類の自発的な探索行動にも影響を及ぼし得る。研究者に検出されないにおいや音は、自発的な行動に依存する認知テストの結果を歪曲させ、マウスを引きつけるか、または反発する可能性があります。最初にY字型迷路または新規物体認識を確立するとき、対象物および/または環境の探索に位置偏りがないことを確実にするための制御手段の実行が不可欠である。位置の偏りが観察された場合、研究者は環境を徹底的に精査し、照明、アリーナの配置、施設内の他の部屋( すなわち 、交通量の多い場所や重機の近くではない)
テスト環境への慣れは、新規オブジェクト認識テストで最適なパフォーマンスを達成するために重要です。例えば、不十分な慣れによる総探査時間の短縮が考えられる。 procの代わりに(セクション2)およびアリーナ(セクション4.2)の慣習、取扱いおよび習慣への慣れを2日連続して3,5分間のセッションとして実施することができる。
技術の限界
どのような手順でも、これらの行動テストには限界があります。これらの手順は、様々な皮質領域および海馬の機能を試験するために採用されている。マウスモデルがこれらの試験によって調べられた脳領域の機能的欠損を示さない場合、これらの技術は有用ではない。さらに、我々は、短期記憶を調べる認知試験を選択した。前臨床評価下での化合物の作用機序が短期記憶に影響しないことが予期されない場合には、これらの手順を適宜変更する( すなわち 、長期記憶を試験するために試料試験相間隔を長くする)。最後に、これらのテストでは動かされない振る舞いを使用します。したがって、マウスモデルがexcesである場合環境の探索を妨げる他の常同振る舞いを表示する場合、これらの手順は最適ではない可能性があります。代わりに、Tg2576または他のβ-アミロイドーシスマウスモデル、またはrTg4510またはタウオパシー3の他のマウスモデルのための空間的水迷路の恐怖調節を使用することができる。
今後のアプリケーション
これらの手順が実験室でうまく採用されれば、追加の認知機能的運動測定を評価するためにいくつかの修正または拡張を行うことができる。例えば、新規オブジェクト認識タスクを変更して、マウスがオブジェクト13の配置の変化を認識できるかどうかを判断する。あるいは、オブジェクトを使用する代わりに、他のマウスを使用して、社会認識のテストを実装することもできます。四肢の抱き合わせ及び運動機能に関して、ワイヤーハンギング及び/又はグリップ強度試験でその試験を補うことができる。テストこの方法で詳述された方法は、ADの翻訳マウスモデルにおいてインビボでの有効性を有する化合物をスクリーニングするための固体塩基を形成し、特定のマウスモデルを最もよく調べたり、独特の創薬プログラムのニーズを満たすために、 。
The authors have nothing to disclose.
著者には謝辞はありません。
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |