George Streisinger börjat använda sig av Danio rerio, allmänt känd som zebrafisk, som ett modellsystem för den genetiska analysen av vertebrat utveckling ^10. Modellen erbjuder flera fördelar inklusive: (1) relativt enkel och billig djurhållning; (2) yttre befruktning, vilket tillåter enkel tillgång till embryon från de tidigaste utvecklingsstadierna; och (3) ett transparent embryo, vilket medger direkt och upprepade observationer av celler, vävnader och organ när de bildas.

Under de följande decennierna, flera framsteg ökade ytterligare kraften i zebrafisk modell. I synnerhet, framåt genetiska skärmar och hel-genomsekvenseringsinsatser spelade nyckelroller vid identifiering av mutationer och gener som är kritiska för många utvecklingsprocesser ^{11, 12, 13, 14,}"> ^{15, 16.} Gateway kloningsmetoder har gjort att rutinmässig tillämpning av transgen närmar ^{17, 18.} Senaste framstegen inom genomet redigering, exemplifieras av transkriptionsaktivator-liknande (Talens) och klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) -Cas9 nukleaser, möjliggöra den målinriktade införandet av mutationer, samt knock-out och knock-in närmar ^{19, 20, 21, 22.} Kombinerade, dessa metoder gör zebrafisk en kraftfull modell för studier av de genetiska mekanismer som ligger bakom specifika beteenden och flera humana sjukdomar ^{23, 24, 25, 26, 27.}

Arbetet är inriktat på att utvecklamental reglering och rollen av elektrisk aktivitet i neuronal utveckling. Fokus ligger på ryggmärgen, som zebrafisk modellen ger flera fördelar. För det första är det relativt lätt att få tillgång till zebrafisk på embryonala och larvstadier; Därför kan man studera ryggmärgen funktion under utvecklingsstadier som har färre nervceller och enklare kretsar ^{28, 29.} Dessutom har zebrafisk ryggmärgen en mångfaldig uppsättning av neuroner, liknande andra ryggradsdjur, såsom demonstreras genom karakteristiska och särskiljande mönster av transkriptionsfaktorer ^{30, 31, 32, 33, 34, 35.}

Majoriteten av studier i zebrafisk som syftar till att avslöja de mekanismer som ligger bakom funktionen hos ryggmärgskretsar, särskiltsådana som stödjer förflyttning, är förståeligt fokuserade på larvstadier ^{36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43.} Dock många av de neuroner som bildar de spinal lokomotivnäten initiera deras differentiering vid tidiga embryonala stadier, ~ 9-10 timmar efter befruktning (HPF) ^{44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51.} Mot bakgrund av detta, att förstå hur de morfologiska och elektriska egenskaperna hos ryggrads nervceller uppstår och förändringen mellan embryonala och larvstadier är viktigt för en Overall förståelse av lokomotorisk kretsbildning och funktion.

De dissektion metoder som beskrivs här tillåter patch clamp-registreringar från spinala neuroner och har tillämpats med framgång på embryonala stadier (~ 17-48 HPF) och larvstadier (~ 3-7 dagar efter befruktning [dpf]). Detta tillvägagångssätt begränsar mängden dissekering som krävs för att ge tillgång till nervceller av intresse. Protokollet skiljer sig från majoriteten av de andra publicerade metoder för inspelning från zebrafisk spinala neuroner i det veterinär sutur lim används, snarare än en fin volfram stift, för att fästa embryo eller larv till inspelningen kammaren. Tillgängligheten av två olika metoder (dvs sutur lim kontra volfram stift) sörjer för montering av de zebrafisk embryon eller larver för elektrofysiologisk analys forskare med alternativa möjligheter att uppnå sina specifika experimentella mål.

Först förfaranden för att få tillgång och inspelning från en pop ulation av primära sensoriska neuroner, Rohon-Beard-celler, beskrivs. Cell organ dessa nervceller ligger inom rygg ryggmärgen. Rohon-Beard celler finns i många ryggradsdjur, skiljer tidigt i utvecklingen, och bakom den embryonala anslagskänslighet ^{6, 44, 47, 48.}

För det andra, förfaranden för att få tillgång och inspelning från spinal motoriska nervceller är detaljerade. Zebrafisk spinala motorneuroner uppstå under två vågor av neurogenes. De tidigare födda primära motoriska nervceller uppstår vid slutet av gastrulation (~ 9-16 HPF), med bara 3-4 primära motoriska nervceller närvarande per hemisegment ^{45, 46, 49.} I motsats, är den senare födda befolkningen av sekundära motoriska nervceller talrikare och uppstår under en långvarig period, som börjar vid ~ 14 hpfef "> ^{45, 50.} Sekundär motor neuron genesis i mitten av trunkavsnitt är oftast kompletteras med 51 HPF ^50. Sekundära motomeuroner anses vara motsvarigheten av motomeuroner i amnioternas ^46. Intressant supraspinala neuroner, via dopamin, reglera locomotion hos larven och sekundär motor neuron genes i embryot och unga larv ^{50, 51.} primära och sekundära motoriska nervceller varje innefatta flera olika subtyper. varje primära motoriska neuron subtyp projekt en perifer axon som innerverar en karakteristisk muskelgrupp, vilket resulterar i en stereotyp, identifiera axonal bana. i allmänhet sekundära motoriska nervceller följer de axonala banorna tidigare fastställts av primära motoriska nervceller. Således, med avseende på axonal banor, primära och sekundära motoriska nervceller är likartade, med undantag av att axonal tjocklek och somata storlek enre större för primära motoriska neuroner ^45.

För det tredje, är metoder för inspelning från ett fåtal typer av interneuronen diskuteras. Emellertid, i dessa fall, är en begränsad mängd av avlägsnandet av andra ryggmärgsceller krävs, och sålunda ryggmärgen är mindre intakt än för inspelningar från Rohon-Beard celler eller motoriska nervceller.