George Streisinger pioneira no uso de Danio rerio, vulgarmente conhecido como peixe-zebra, como um sistema modelo para a análise genética do desenvolvimento dos vertebrados ^10. O modelo oferece várias vantagens, incluindo: (1) criação de animais relativamente simples e de baixo custo; (2) a fertilização externa, permitindo um acesso fácil aos embriões desde os primeiros estádios de desenvolvimento; e (3) um embrião transparente, permitindo observações directas e repetidas de células, tecidos e órgãos, como eles formam.

Ao longo das décadas que se seguiram, vários avanços aumentou ainda mais o poder do modelo peixe-zebra. Em particular, telas genéticos para a frente e os esforços de sequenciação de todo o genoma desempenharam um papel-chave na identificação de mutações e genes críticos para muitos processos de desenvolvimento ^{11, 12, 13, 14,}"> ^15, os métodos de clonagem ^16. Gateway permitiram a aplicação de rotina transgénico se aproxima de ^{17, 18.} Recentes avanços na edição genoma, exemplificado pelo activador da transcrição do tipo (TALENS) e agrupados repete regularmente interspaced curtas palindrómicos (CRISPR) -Cas9 nucleases, permitir a introdução alvo de mutações, bem como knock-out e knock-in se aproxima de ^{19, 20, 21, 22.} Combinada, estes métodos fazem peixe-zebra um poderoso modelo para o estudo dos mecanismos genéticos subjacentes comportamentos específicos e várias doenças humanas ^{23, 24, 25, 26, 27.}

Este trabalho se concentra em desenvolverregulação mental e o papel da atividade elétrica no desenvolvimento neuronal. O foco é sobre a medula espinal, para os quais o modelo de peixe-zebra proporciona várias vantagens. Em primeiro lugar, é relativamente fácil de acessar peixe-zebra em estágios embrionários e larval; portanto, pode-se estudar a função da medula espinal durante os estágios de desenvolvimento que têm menos neurónios e circuitos mais simples ^{28, 29.} Além disso, a espinal medula de peixe-zebra tem um conjunto diversificado de neurónios, semelhante a outros vertebrados, como demonstrou padrões característicos e distintivas de factores de transcrição ^{30, 31, 32, 33, 34, 35.}

A maioria dos estudos em peixes-zebra que têm como objectivo de desvendar os mecanismos subjacentes à função de circuitos da medula espinhal, especialmenteaqueles que suportam a locomoção, são compreensivelmente focada em estágios larvais ^{36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43.} No entanto, muitos dos neurónios que formam as redes locomotiva espinhais iniciar a sua diferenciação em estágios embrionários iniciais, ~ 9-10 h pós-fertilização (HPF) ^{44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51.} Em vista disso, a compreensão de como as propriedades morfológicas e eléctricas dos neurónios espinais e surgem alterações entre os estágios embrionários e larval é importante para uma overacompreensão ll de formação e função circuito locomotor.

Os métodos aqui descritos permitem dissecção gravações de patch clamp de neurónios espinais e têm sido aplicados com sucesso em estágios embrionários (~ 17-48 HPF) e as fases larvares (~ 3-7 dias após a fertilização [dpf]). Esta abordagem limita a quantidade de dissecção requerida para fornecer acesso aos neurônios de interesse. O protocolo difere da maioria dos outros métodos publicados para a gravação de neurónios espinais zebrafish em que a cola veterinário sutura é utilizado, em vez de um pino de tungsténio finos, para fixar o embrião ou larva para a câmara de registo. A disponibilidade de duas abordagens diferentes (isto é, cola de sutura contra o pino de tungsténio) para a montagem dos embriões de peixe-zebra ou larvas para análise electrofisiológica fornece investigadores com opções alternativas para alcançar os seus objectivos específicos experimentais.

Em primeiro lugar, os procedimentos para acessar e gravar a partir de um pop ulação de neurónios sensoriais primários, células Rohon-Beard, são descritos. Os corpos celulares destes neurónios se encontram dentro da espinal medula dorsal. Existem células Rohon-Beard em numerosas espécies de vertebrados, diferenciar no início do desenvolvimento, e estão subjacentes à resposta ao toque embrionário ^{6, 44, 47, 48.}

Em segundo lugar, os procedimentos de acesso e gravação de neurónios motores espinais são detalhados. Zebrafish neurónios motores espinais surgir durante duas ondas de neurogese. Os neurónios motores primários anterior-nascidos surgem no final da gastrulação (~ 9-16 HPF), com apenas 3-4 neurónios motores primária presentes por hemisegmento ^{45, 46, 49.} Em contraste, a população depois-nascido de neurónios motores secundários é mais numerosos e surge durante um período prolongado, a partir das ~ 14 hpfef "> ^{45, 50.} Secundário neurônio motor gênese nos segmentos mid-tronco é principalmente concluída até 51 hpf ^50. neurônios motores secundários são considerados a contrapartida dos neurônios motores em amniotes ^46. Curiosamente, os neurônios supraespinhais, via dopamina, regular locomoção na larva e motor secundário neurónio génese no embrião e jovem larva ^{50, 51.} neurónios motores primários e secundários compreendem cada um vários subtipos diferentes. cada motor primário projectos neurónio subtipo a de axónios periférica que inerva um grupo muscular característico, resultando em um estereotipada, identificar trajectória axonal. Geralmente, os neurónios motores secundários seguir as vias axonais previamente estabelecidos por neurónios motores primários. Assim, no que diz respeito a trajectórias axonal, os neurónios motores primária e secundária são semelhantes, com a excepção de que a espessura axonal e uma somata tamanhore maior para os neurónios motores primários ^45.

Em terceiro lugar, são discutidos métodos para gravação de alguns tipos de interneurônios. No entanto, nestes casos, é necessária uma limitada quantidade de remoção de outras células do cordão espinal, e, assim, a medula espinal é menos intacta do que para as gravações de células Rohon-barba ou neurónios motores.