George Streisinger aperto la strada all'uso di Danio rerio, comunemente noto come pesce zebra, come sistema modello per l'analisi genetica di sviluppo dei vertebrati ^10. Il modello offre diversi vantaggi tra cui: (1) relativamente semplice e poco costoso zootecnia; (2) fecondazione esterna, consente un facile accesso alle embrioni dalle prime fasi di sviluppo; e (3) un embrione trasparente, permettendo osservazioni dirette e ripetute di cellule, tessuti e organi in quanto costituiscono.

Nel corso dei decenni successivi, numerosi miglioramenti aumentato ulteriormente la potenza del modello di zebrafish. In particolare, gli schermi genetici avanti e sforzi sequenziamento dell'intero genoma giocato un ruolo chiave nella identificazione di mutazioni e geni critici per molti processi di sviluppo ^{11, 12, 13, 14,}"> ^{15, 16} metodi di clonazione. Gateway hanno permesso l'applicazione di routine di transgenico si avvicina a ^{17, 18.} I recenti progressi nella modifica del genoma, esemplificato dalla trascrizione attivatore-simile (Talens) e cluster regolarmente intervallati ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) -Cas9 nucleasi, consentire l'introduzione mirata di mutazioni, così come knock-out e knock-in si avvicina ^{19, 20, 21, 22.} combinata, questi metodi fanno zebrafish un potente modello per lo studio dei meccanismi genetici sottostanti specifici comportamenti e diverse malattie umane ^{23, 24, 25, 26, 27.}

Questo lavoro si concentra su svilupporegolazione mentale e il ruolo dell'attività elettrica nello sviluppo neuronale. L'attenzione è sul midollo spinale, per cui il modello zebrafish fornisce diversi vantaggi. In primo luogo, è relativamente facile accedere zebrafish nelle fasi embrionali e larvali; Pertanto, si può studiare la funzione del midollo spinale durante fasi di sviluppo che hanno meno neuroni e semplice circuiteria ^{28, 29.} Inoltre, il midollo spinale zebrafish ha un diverso insieme di neuroni, simile ad altri vertebrati, come dimostrato dai modelli caratteristici e distintivi di fattori di trascrizione ^{30, 31, 32, 33, 34, 35.}

La maggior parte degli studi in zebrafish che mirano a scoprire i meccanismi che stanno alla base del funzionamento dei circuiti del midollo spinale, specialmentequelli che supportano locomozione, sono comprensibilmente focalizzati su stadi larvali ^{36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43.} Tuttavia, molti dei neuroni che formano le reti locomotiva spinali iniziato la loro differenziazione nelle fasi embrionali, ~ 9-10 ore dopo la fecondazione (HPF) ^{44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51.} In considerazione di ciò, comprendere come le proprietà morfologiche ed elettriche dei neuroni spinali sorgono e cambiamento tra gli stadi embrionali e larvali è importante per un overall comprensione della formazione circuito motorio e funzione.

I metodi di dissezione qui descritti permettono registrazioni di patch clamp da neuroni spinali e sono stati applicati con successo nelle fasi embrionali (~ 17-48 HPF) e stadi larvali (~ 3-7 giorni dopo la fecondazione [dpf]). Questo approccio limita la quantità di dissezione necessaria per fornire l'accesso ai neuroni di interesse. Il protocollo differisce dalla maggior parte degli altri metodi pubblicati per la registrazione da neuroni spinali zebrafish a che la colla veterinario sutura viene utilizzata, anziché un perno di tungsteno fine, per fissare l'embrione o larva alla camera di registrazione. La disponibilità di due approcci differenti (cioè, colla sutura rispetto al perno tungsteno) per il montaggio delle zebrafish embrioni o larve per l'analisi elettrofisiologica fornisce ai ricercatori opzioni alternative per raggiungere i loro obiettivi sperimentali specifiche.

In primo luogo, le procedure per l'accesso e la registrazione da un pop ulation di neuroni sensoriali primarie, cellule ROHON-barba, sono descritti. I corpi cellulari di questi neuroni si trovano all'interno del midollo spinale dorsale. Cellule ROHON-barba esistono in numerose specie di vertebrati, differenziano prime fasi di sviluppo, e alla base la risposta al tocco embrionale ^{6, 44, 47, 48.}

In secondo luogo, le procedure per l'accesso e la registrazione da motoneuroni spinali sono dettagliate. Zebrafish motoneuroni spinali sorgono durante due onde di neurogenesi. Motoneuroni primari precedenza nati sorgono a fine gastrulazione (~ 9-16 HPF), con solo 3-4 motoneuroni primari presenti per hemisegment ^{45, 46, 49.} Al contrario, la popolazione più tardi-nato motoneuroni secondari è più numerose e si verifica durante un periodo prolungato, da ~ 14 HPFef "> ^{45, 50.} secondario motoneurone genesi segmenti metà tronco principalmente è completata da 51 HPF ^50. motoneuroni secondari sono considerati la controparte dei motoneuroni del amnioti ^46. È interessante notare che i neuroni sovraspinali, tramite dopamina, regolano locomozione la larva e motore secondario neurone genesi nell'embrione e giovane larva ^{50, 51.} motoneuroni primari e secondari comprendono ciascuno diversi sottotipi differenti. ogni motore primario progetti neurone sottotipo un assoni periferici che innerva un gruppo muscolare caratteristico, con un conseguente stereotipo, identificando traiettoria assonale. Generalmente, i motoneuroni secondari seguono percorsi assonale prestabiliti dalla motoneuroni primari. Pertanto, rispetto a traiettorie assoni, motoneuroni primari e secondari sono simili, con l'eccezione che lo spessore assonale e somata dimensione are maggiore per motoneuroni primari ^45.

In terzo luogo, i metodi per la registrazione da alcuni tipi di interneuroni sono discussi. Tuttavia, in questi casi, è richiesta una quantità limitata di rimozione di altre cellule del midollo spinale, e quindi il midollo spinale è meno intatta che per registrazioni da cellule ROHON-barba o neuroni motori.