Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen
Summary
This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Abstract
In den letzten zehn Jahren wurden Channelrhodopsine in der neurowissenschaftlichen Forschung unentbehrlich, wo sie als Werkzeuge zur nicht-invasiven Manipulation elektrischer Prozesse in Zielzellen verwendet werden. In diesem Zusammenhang ist die Ionenselektivität eines Kanalrhodopsins von besonderer Bedeutung. Dieser Artikel beschreibt die Untersuchung der Chloridselektivität für ein kürzlich identifiziertes anion-leitendes Kanalrhodopsin von Proteomonas sulcata über elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen auf HEK293-Zellen. Das experimentelle Verfahren zur Messung von lichtgesteuerten Photoströmen erfordert eine schnell umschaltbare – idealerweise monochromatische – Lichtquelle, die in das Mikroskop eines ansonsten konventionellen Patch-Clamp-Setups eingekoppelt ist. Vorbereitende Verfahren vor dem Experiment werden unter Berücksichtigung von gepufferten Lösungen, Überlegungen über Flüssigkeitsübergangspotentiale, Seeding und Transfektion von Zellen und Ziehen von Patchpipetten skizziert. Die tatsächliche Aufzeichnung der Strom-Spannungs-BeziehungS zur Bestimmung der Umkehrpotentiale für verschiedene Chloridkonzentrationen findet nach der Transfektion 24 h bis 48 h statt. Schließlich werden elektrophysiologische Daten in Bezug auf theoretische Überlegungen zur Chloridleitung analysiert.
Introduction
Channelrhodopsine (ChR) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle, die im Augenfleck von beweglichen Grünalgen vorkommen und als primäre Photosensoren für Phototaxis und phobische Reaktionen dienen 1 . Seit ihrer ersten Beschreibung im Jahr 2002 haben die ChRs den Weg für das entstehende Feld der Optogenetik geebnet und können in einer Vielzahl von erregbaren Zellen angewendet werden, z. B. in Skelettmuskeln, im Herzen oder im Gehirn 3 , 4 , 5 . Die Expression von ChRs in Zielzellen führt zu einer lichtsteuerbaren Ionenpermeabilität der jeweiligen Zelle. In einem neuronalen Kontext ermöglicht dies die Aktivierung 6 , 7 , 8 oder die Hemmung 9 , 10 des Aktionspotentials (AP), die – abhängig vom geführten Ion – mit dem räumlichen und zeitlichen abfeuertPräzision des Lichts, die hervorhebt, wie die Ionenselektivität einer ChR-Variante ihre optogenetische Anwendung bestimmt.
Die ersten entdeckten ChRs von Chlamydomonas reinhardtii und Volvox carteri sind für Protonen durchlässig, aber auch für monovalente Kationen wie Natrium, Kalium und in geringerem Maße zu zweiwertigen Kationen wie Calcium und Magnesium 11 , 12 , 13 . Heute sind mehr als 70 natürliche kationenleitende Kanalrhodopsine (CCRs) 14 , 15 , 16 , 17 und mehrere konstruierte Varianten 18 , 19 , 20 mit unterschiedlichen Eigenschaften wie Photostromgröße, spektrale Empfindlichkeit, Kinetik und Kationenselektivität stehen zur Verfügung. Während in der Neurowissenschaften, CCRs aRe verwendet, um Zellen zu aktivieren und APs auszulösen, waren lichtgetriebene mikrobielle Pumpen die einzigen verfügbaren Antagonisten für die Stummschaltung von Neuronen seit Jahren. Im Jahr 2014 zeigten zwei Gruppen gleichzeitig, dass CCRs durch Veränderung der Polarität entlang der putativen Ionen leitenden Pore über molekulare Technik 9 , 21 in anion-leitende Kanalrhodopsine (ACRs) umgewandelt werden können . Anschließend wurden natürliche ACRs in mehreren Kryptophytenalgen 22 , 23 , 24 identifiziert. Am wichtigsten ist, dass die Lichtaktivierung von ACRs Chloridströme in erwachsenen Neuronen vermittelt, was eine Hemmung der neuronalen Aktivität bei viel geringeren Lichtintensitäten ermöglicht als mikrobielle Pumpen, die nur einzelne Ladungen pro absorbiertem Photon transportieren.
Die ChR-Aktivität kann direkt durch elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen von lichtinduzierten Strömen in HEK293-Zellen adressiert werden. Die Patch-ClampTechnik wurde ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt und weiter verbessert von Hamill et al. , Wodurch die Aufzeichnung der Entität von Strömen aus einer kleinen Zelle (Ganzzellenmodus) mit hoher Stromauflösung und direkter Steuerung der Membranspannung 26 ermöglicht wird. In der Zellkultur angewendet, bietet diese Technik eine genaue Kontrolle sowohl der ionischen als auch der elektrischen Aufzeichnungsbedingungen und ermöglicht die Untersuchung der Ionenselektivität zusammen mit dem relativen Beitrag der Ionen zum Gesamtstrom. Hier veranschaulichen wir die Untersuchung der Ionenselektivität für das anion-leitende Kanalrhodopsin von Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 über die Aufzeichnung von Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen extrazellulären Chlorid-Konzentrationen, um eine hohe Chlorid-Leitfähigkeit zu beweisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bestimmung von Umkehrpotentialen bei definierten ionischen und elektrischen Bedingungen liefert Informationen über die nach der Lichtaktivierung von ChRs transportierten Ionenspezies. Wenn nur eine Ionenspezies in einem komplexen physiologischen Medium variiert wird und die erhaltenen Umkehrpotentialverschiebungen nach dem theoretischen Nernstpotential sind, ist diese Ionensorte die einzige transportierte.
Für ChRs sind jedoch Umkehrpotentialverschiebungen in der Regel weniger ausgepr?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Maila Reh, Tharsana Tharmalingam und vor allem Altina Klein für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 bis PH) und dem Exzellenzcluster Vereinigungskonzepte in der Katalyse, UniCat, BIG-NSE (JV) und E4 (PH) unterstützt.
Materials
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
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