Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1
Summary
G4 Resolvase1 bindet an G-Quadruplex (G4) Strukturen mit dem engsten berichteten Affinität für ein G4-Bindungsprotein und stellt die Mehrheit der G4-DNA Abwickeln Aktivität in HeLa-Zellen. Wir beschreiben ein neuartiges Protokoll, das die Affinität und ATP-abhängige Abwickeln Aktivität von G4-Resolvase1 nutzt gezielt katalytisch aktive rekombinante G4R1 reinigen.
Abstract
Höherwertige Nukleinsäurestrukturen G-Quadruplexe (G4S, G4 Strukturen) in guaninreichen Regionen sowohl DNA als auch RNA und sind thermisch hochstabile Form genannt. Es gibt> 375.000 putative G4 bildenden Sequenzen im menschlichen Genom, und sie sind in Promotorregionen, untranslatierten Regionen (UTRs) angereichert, und innerhalb der telomeren Wiederholungs. Aufgrund des Potenzials für diese Strukturen zellulärer Prozesse zu beeinflussen, wie beispielsweise Replikation und Transkription wurde die Zellenzyme entwickelt sie zu verwalten. Ein solches Enzym ist G4 Resolvase 1 (G4R1), die biochemisch wurde zusammen gekennzeichnet durch unser Labor und Nagamine et al. und zu binden , extrem eng sowohl G4-DNA und RNA-G4 (K d im Nieder pM – Bereich) gefunden. G4R1 ist die Quelle der Mehrzahl der G4-Auflösungsaktivität in Lysaten HeLa-Zelle und hat eine Rolle, da eine Rolle bei telomere Stoffwechsel, Lymphe Entwicklung, Gentranskription, Hämatopoese und Immunüberwachung spielen. Die Fähigkeit, efzient Expression und Aufreinigung katalytisch aktive G4R1 von Bedeutung ist für die Laboratorien an weiteren Einblick in die kinetische Interaktion von G4 Strukturen und G4-Lösung Enzyme zu gewinnen. Hier beschreiben wir eine detaillierte Verfahren zur Reinigung von rekombinantem G4R1 (rG4R1). Das beschriebene Verfahren beinhaltet die herkömmliche affinitätsbasierte Reinigung eines C-terminalen Histidin-markiertes Enzym in menschlichen Codon-optimierten ausgedrückt Bakterien mit der Ausnutzung der Fähigkeit von rG4R1 zu binden und G4-DNA Entspannen hochaktive Enzym in einer ATP- zu reinigen abhängige Elutionsschritt. Das Protokoll enthält außerdem ein Qualitätskontrollschritt, bei dem die enzymatische Aktivität von rG4R1 durch Untersuchung der Fähigkeit des gereinigten Enzyms gemessen wird G4-DNA zu entspannen. Außerdem wird ein Verfahren beschrieben, das für die Quantifizierung von gereinigtem rG4R1 ermöglicht. Alternative Anpassungen dieses Protokolls werden diskutiert.
Introduction
G4 Strukturen sind hochstabile Nukleinsäuresekundärstrukturen, die innerhalb Guanin-reichen Regionen von DNA und RNA bilden. G4 Strukturen werden über Hoogsteen-Bindungswechselwirkungen stabilisiert und koordinative Bindung innerhalb des zentralen Hohlraums mit einwertigen Kationen (d. K + und Na +), die zu der bemerkenswerten thermischen Stabilität von G4 Strukturen 1, 2 wesentlich beitragen. Frühe Bioinformatik Studien vorgeschlagen , dass das menschliche Genom enthält> 375.000 "potential G4 bildenden Motive" 3, 4. Neuere Studie Schätzungen deuten darauf hin , dass die Anzahl der G4 – Motive höher ist um einen Faktor von 2-5 5, während eine andere Studie 716.310 unterschiedliche Potential G4 bildenden prognostiziert 6 Sequenzen im menschlichen Genom. G4-bildende Sequenzen sind evolutionär konserviert und nicht willkürlich verteilt indas Genom. G4 – Motive sind in Gen kodierenden Regionen angereichert und nach oben von 40% der Gen – Promotoren enthalten G4 Motive 7. Interessanterweise hat der Grad der Anreicherung von G4-Motive in einem Gen demonstriert worden, um die Funktion des Gens zu suggerieren. Zum Beispiel haben proto-Onkogenen und Gene in Entwicklung beteiligt signifikant größere Anreicherung von G4 Strukturen als Tumorsuppressorgene 8, 9.
Mit hoher thermischer Stabilität, eine fast allgegenwärtige Präsenz im gesamten Genom, und das Potenzial, deutlich größeren zellulären Prozesse beeinflussen, ist es wenig überraschend zu finden, dass die Zelle Enzyme zu verwalten, diese Strukturen entwickelt hat. Ein solches Enzym ist G4 Resolvase1 (G4R1; auch Rhau und DHX36 genannt), die wir als die Quelle der meisten tetra G4-DNA Auflösungs Aktivität charakterisiert in menschlichen (HeLa) Zellen 10. Seitdem hat es sich gezeigt, That G4R1 fest bindet und abwickelt katalytisch tetra und unimolekularer G4-DNA und G4-RNA mit den engsten berichteten KDs für einen G4-bindendes Protein 11, 12, 13. Zusätzlich hat die G4-Auflösungs Aktivität von G4R1 wurde in einer Vielzahl von biochemischen und zellulären Prozessen beteiligt, einschließlich telomere / Telomerase biology 11, 14, 15, 16, Transkription und Splicing 17, 18, 19, 20, Entwicklung 21, Hämatopoese 21, und der Immunregulation 22, 23. Mit einem Übergewicht der G4-Sequenzen spezifisch im gesamten Genom und die diverse zelluläre p gelegenrozesse dass G4R1 die Fähigkeit hat zu verwickelt beteiligt mit kurzem wurde, zu exprimieren und zu reinigen, effizient hochaktiven rG4R1 von äußerster Wichtigkeit ist, die biochemischen Mechanismen, und das Verhalten dieses Proteins für die Aufklärung.
Hier zeigen wir eine neuartige Expression und Reinigungsschema (Figur 1) , die die Vorteile der ATP-abhängige, G4-Auflösungs Aktivität von rG4R1 effizient isolieren aktiven Enzyms führt. Dieses Schema könnte angepasst werden, um andere ATP-abhängigen, für die Nukleinsäure-Enzyme zu reinigen das Produkt der enzymatischen Reaktion ist nicht länger ein Substrat für die Bindung, wie es der Fall für G4R1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine hocheffiziente Expression, Reinigung und Quantifizierung Schema für die Isolierung des DHX36 Genprodukts, G4-Resolvase1 (G4R1, auch Rhau und DHX36 genannt) (Abbildung 1). Dieses Protokoll verwendet zwei Reinigungsschritte: His-Tag Affinitätsreinigung an Kobalt Affinitätsbeads und enzymatische Reinigung auf G4-DNA-konjugierten Perlen. Der letzte Schritt ist einzigartig, da es die Vorteile der engen Affinität nimmt, hohe Spezifität und katalytische Aktivität, die Abwicke…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten unsere Finanzierungsquellen zu danken, darunter ein großzügiges Geschenk von der Ware Foundation (auf JPV) Die National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (zu PJS), und der Ball State University Startfonds (zu PJS). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen.
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
Referências
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