Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes
Summary
A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.
Abstract
No cérebro, os sistemas de tráfico de membrana desempenham papéis importantes na regulação de funções neuronais, como morfologia neuronal, plasticidade sináptica, sobrevivência e comunicações gliais. Até à data, numerosos estudos têm relatado que defeitos nestes sistemas causam várias doenças neuronais. Assim, a compreensão dos mecanismos subjacentes à dinâmica das vesículas pode fornecer pistas influentes que poderiam auxiliar no tratamento de vários distúrbios neuronais. Aqui, descrevemos um método para quantificar motilidades de vesículas, tais como a distância de motilidade e a velocidade de movimento, utilizando um plug-in de software para a plataforma ImageJ. Para obter imagens para quantificação, marcamos estruturas de endossomas neuronais-lisossomas com proteínas marcadoras de vesículas marcadas com EGFP e observamos o movimento de vesículas usando uma microscopia de lapso de tempo. Este método é altamente útil e simplifica a medição da motilidade vesicular em neurites, tais como axônios e dendritos, bem como no soma de ambos os neurônios e células gliais. MaismoRe, este m�odo pode ser aplicado a outras linhas celulares, tais como fibroblastos e c�ulas endoteliais. Esta abordagem poderia fornecer um avanço valioso da nossa compreensão do tráfico de membrana.
Introduction
O controle preciso do tráfico de endossomas-lisossomos é indispensável para a regulação da função neuronal. Notavelmente, os movimentos dinâmicos destas vesículas são um factor chave subjacente à regulação da morfologia neuronal, desenvolvimento e sobrevivência. Defeitos neste sistema causam graves distúrbios neuronais 1 , 2 . Os mecanismos moleculares que ligam o tráfico de vesículas a doenças neuronais são considerados complicados, e vários grupos têm procurado examinar essa relevância. Por exemplo, foi relatado que a motilidade endosómica tardia perturbada está significativamente associada com a doença 3 de Niemann-Pick C, uma doença neurodegenerativa hereditária causada por defeitos de lisossoma. Outro exemplo é uma mutação num canal de Ca 2+ lisossómico , trpml 1, que prejudica a motilidade lisossómica, resultando em doenças de armazenamento lisossomal 4 , 5 , </Sup> 6 . Nosso grupo relatou que a desregulação do PtdIns (3,5) P 2 volume de negócios suprime endosome e motilidade lisossomo nos neurônios, levando a um aumento da vulnerabilidade à resposta ao estresse 7 , 8 . A regulação metabólica de PtdIns (3,5) P 2 , que localiza principalmente os endossomas e os lisossomas tardios, desempenha um papel importante em uma ampla variedade de funções celulares, incluindo o tráfico de vesículas e os processos de fusão-fissão 9,10. Uma vez que o PtdIns (3,5) P 2 alterado provoca neurodegeneração grave 11,12, a regulação aberrante da motilidade endosoma-lisossoma pode ser um fator chave para a compreensão da patogênese da neurodegeneração. Uma investigação dos mecanismos moleculares subjacentes à motilidade vesicular pode assim fornecer pistas promissoras que podem aprofundar a nossaVários distúrbios neuronais.
Neste artigo, introduzimos um valioso método para quantificar a motilidade vesicular em neurônios usando um pacote de software livre chamado Manual Tracking. O objetivo foi desenvolver um método de quantificação rápida para analisar a motilidade vesicular. Esta quantificação é dirigida através de uma abordagem padrão de clicar em um ponto de referência em cada quadro de um filme de lapso de tempo. O uso do software de rastreamento manual torna essa abordagem bastante simples e de ampla utilidade, ao contrário de outras aplicações. Além disso, esta abordagem é também aplicável a outras células, tais como células gliais. Embora este método seja primitivo, pode ser aplicado a várias análises, incluindo a motilidade celular ea alteração morfológica. Por exemplo, depois de definir um ponto de referência em uma seqüência de imagens, informações sobre as posições dos pontos de referência eo tempo em cada posição podem ser extraídos de imagens seqüenciais usando a análise de dados e softwares de processamento de imagenslouça. Tomados em conjunto, este método é simples, mas poderoso e contribui para o desenvolvimento de maior eficiência em estudos baseados no tráfico de membranas, como aqueles que examinam a função do endossoma-lisossoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo introduz o procedimento para quantificar a motilidade vesicular. Nos neurônios primários, os endossomos e os lisossomos tendem a apresentar alta motilidade em neurônios mais jovens (4-6 DIV). Dado que os neurônios devem fornecer alguns componentes para os bordos de ataque para alongar os processos neurais, o tráfico de membranas deve ocorrer dinamicamente durante esta fase. Assim, é importante usar neurônios mais jovens para observar a motilidade dinâmica em dendritos neuronais. Além disso, vesí…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Ricardo Dolmetsch (Faculdade de Medicina da Universidade de Stanford, afiliação atual: Novartis Institutes for Biomedical Research) por ajudar a desenvolver essa análise e ao Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara e Dongsook Kim por sua leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
Referências
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