Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes
Summary
La investigación del tráfico de membranas es crucial para entender las funciones neuronales. Aquí, se introduce un método para la cuantificación de la motilidad vesicular en las neuronas. Este es un método conveniente que puede adaptarse a la cuantificación del tráfico de membranas en el sistema nervioso.
Abstract
En el cerebro, los sistemas de tráfico de membrana desempeñan un papel importante en la regulación de las funciones neuronales, como la morfología neuronal, la plasticidad sináptica, la supervivencia y las comunicaciones gliales. Hasta la fecha, numerosos estudios han informado de que los defectos en estos sistemas causan diversas enfermedades neuronales. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos subyacentes dinámica de las vesículas puede proporcionar influyentes pistas que podrían ayudar en el tratamiento de varios trastornos neuronales. Aquí, describimos un método para cuantificar las motilidades vesicales, tales como la distancia de motilidad y la velocidad de movimiento, utilizando un plug-in de software para la plataforma ImageJ. Para obtener imágenes para la cuantificación, que etiquetados neuronal endosoma-lisosoma estructuras con EGFP marcado vesícula marcador proteínas y observó el movimiento de vesículas utilizando un lapso de tiempo microscopía. Este método es muy útil y simplifica la medición de la motilidad vesicular en las neuritas, tales como axones y dendritas, así como en el soma de ambas neuronas y células gliales. Más alláRe, este método puede aplicarse a otras líneas celulares, tales como fibroblastos y células endoteliales. Este enfoque podría proporcionar un valioso avance en nuestra comprensión del tráfico de membranas.
Introduction
El control preciso del tráfico de endosomas y lisosomas es indispensable para regular la función neuronal. En particular, los movimientos dinámicos de estas vesículas son un factor clave que subyace a la regulación de la morfología neuronal, el desarrollo y la supervivencia. Los defectos en este sistema causan trastornos neuronales graves 1 , 2 . Los mecanismos moleculares que vinculan el tráfico de vesículas a las enfermedades neuronales se consideran complicados, y varios grupos han tratado de examinar esta relevancia. Por ejemplo, se ha informado de que la motilidad endosómica tardía perturbada está significativamente asociada con la enfermedad de Niemann-Pick C 3 , un trastorno neurodegenerativo hereditario causado por defectos de lisosomas. Otro ejemplo es una mutación en un canal de Ca 2+ lisosomal , trpml 1, que altera la motilidad lisosomal, dando como resultado enfermedades de almacenamiento lisosomal 4 , 5 , </Sup> 6 . Nuestro grupo ha informado de que la desregulación de PtdIns (3,5) P 2 volumen de negocios suprime endosoma y lisosoma motilidad en las neuronas, lo que conduce a un aumento de la vulnerabilidad a la respuesta al estrés 7 , 8 . La regulación metabólica de PtdIns (3,5) P 2 , que en su mayoría se localiza en endosomas tardíos y lisosomas, juega un papel importante en una amplia variedad de funciones celulares, incluyendo el tráfico de vesículas y los procesos de fusión-fisión 9,10. Dado que el deterioro de PtdIns (3,5) P 2 volumen de negocios causa neurodegeneración grave 11 , 12 , la regulación aberrante de la motilidad endosoma-lisosoma podría ser un factor clave para la comprensión de la patogénesis de la neurodegeneración. Una investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la motilidad vesicular puede proporcionar pistas prometedoras que pueden profundizar nuestroDe varios trastornos neuronales.
En este artículo, introducimos un valioso método para cuantificar la motilidad de las vesículas en las neuronas utilizando un paquete de software gratuito llamado Manual Tracking. El objetivo fue desarrollar un método de cuantificación rápida para analizar la motilidad vesicular. Esta cuantificación se dirige a través de un enfoque estándar de hacer clic en un punto de referencia en cada fotograma de una película de tiempo transcurrido. El uso del software de seguimiento manual hace este enfoque bastante simple y de amplia utilidad, a diferencia de otras aplicaciones. Además, este enfoque es también aplicable a otras células, como las células gliales. Aunque este método es primitivo, puede aplicarse a diversos análisis, incluyendo la motilidad celular y el cambio morfológico. Por ejemplo, después de definir un punto de referencia a través de una secuencia de imágenes, la información sobre las posiciones de los puntos de referencia y el tiempo en cada posición se pueden extraer de imágenes secuenciales utilizando análisis de datos y procesamiento de imagen suavemercancía. En conjunto, este método es simple pero potente y contribuye al desarrollo de una mayor eficiencia en los estudios basados en el tráfico de membranas, como los que examinan la función del endosoma-lisosoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo introduce el procedimiento para cuantificar la motilidad vesicular. En las neuronas primarias, los endosomas y los lisosomas tienden a mostrar una alta motilidad en las neuronas más jóvenes (4-6 DIV). Dado que las neuronas deben entregar algunos componentes a los bordes delanteros a los procesos neurales alargados, el tráfico de la membrana debe ocurrir dinámicamente durante esta etapa. Por lo tanto, es importante utilizar las neuronas más jóvenes para observar la motilidad dinámica en las dendrita…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Ricardo Dolmetsch (Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford, afiliación actual: Novartis Institutes for Biomedical Research) por ayudar a desarrollar este análisis y al Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara y Dongsook Kim por su lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
Referências
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