Under utveckling, neuroner arbetade Dendrites i komplexa men stereotypa grenade mönster bildar synapser med sina presynaptiska partner. Dendritiska förgrening mönster korrelerar med neuronal identitet och funktioner. Platserna för dendritiska hållare avgöra vilken typ av presynaptiska ingångar de får, medan dendritiska förgrening komplexitet och fältstorlek styr ingångsnummer. Således, dendritiska morfologiska egenskaper har en avgörande betydelse för synaptiska uppkoppling och neuronal beräkning. I många regioner i komplexa hjärnor, såsom fly optiska loberna och ryggradsdjur näthinnan, är synaptiska kretsar organiserade i kolumner och lager för att underlätta informationsbehandling ^{1, 2.} I en sådan kolonn och skikt organisation, till presynaptiska neuroner på en avgränsad modalitet projekt axoner slutar vid ett visst lager (s k skiktet specifik inriktning) och bilda en ordnad två-dimensionell array (så called topografisk karta), medan postsynaptiska neuroner sträcker dendriter av lämplig storlek i särskilda lager för att få presynaptiska ingångar rätt typer och siffror. Medan axonal inriktning på lager och kolumner har studerats ^{3, 4,} är mycket mindre känt om hur dendriter dirigeras till specifika skikt och expandera lämplig storlek receptiva fält för att bilda synaptiska kontakter med rätt presynaptiska partner ^5. Svårigheten att avbildning och kvantifiering av dendritiska inriktning på lager och kolumner har hindrat studiet av dendritiska utveckling i kolonn och laminerade hjärnstrukturer.

Drosophila medulla nervceller är en idealisk modell för att studera dendritiska routing och kretsenheten i kolumnerna och lager. Flugan förlängda neuropil är organiserat som en 3D-gitter av 10 lager och cirka 750 kolumner. Varje kolumn innerveras av en uppsättning av afferenter, inklusive photoreceptors R7 / R8 och lamina neuroner L1 – L5, vars axonal terminaler bildar topografiska kartor i ett lager-specifikt sätt ^6. Cirka 38 typer av medulla neuroner förekommer i varje förlängda kolonn och genomarbetade dendriter i specifika skikt och med lämplig storlek fält att ta emot insignaler från dessa afferenter ^7. De synaptiska kretsar i märgen har rekonstruerats på elektronmikroskopnivå; sålunda är de synaptiska partnerskap väletablerat ^{7, 8.} Vidare genetiska verktyg för märkning av olika typer av medulla nervceller är tillgängliga ^{9, 10, 11.} Genom att undersöka tre typer av transmedulla (TM) neuroner (Tm2, TM9 och TM20), har vi tidigare identifierat två cell typspecifika dendritiska egenskaper: (i) Tm neuroner skjuter dendriter i antingen den främre eller bakre riktningen (plan projektion riktningen), beroende på de celltyper och (ii) dendriterna i medulla neuroner slutar i specifika medulla skikt i en cell-typ-specifikt sätt (skikt-specifik terminering) ^12. Planprojektion riktning och lager specifika terminering är tillräckliga för att skilja mellan dessa tre typer av Tm neuroner, medan mutationer som stör Tm svar på lager och kolumn ledtrådar påverkar olika aspekter av dessa attribut.

Här presenterar vi ett komplett arbetsflöde för att undersöka dendritiska mönstring av Drosophila medulla neuroner i kolumner och skikt (Figur 1). Först visar vi en dubbel-view avbildningsmetod, som använder anpassad programvara för att kombinera två konfokala bild stackar att generera isotropa bilder av hög kvalitet. Denna metod kräver endast konventionell konfokalmikroskopi att generera bilder med hög kvalitet som möjliggör tillförlitlig spårning av dendritiska grenar, utan att tillgripa superupplösning mikroskopi, en sådans STED (stimulerad emission Utarmning) eller strukturell belysning. För det andra presenterar vi en metod för att spåra dendritiska hållare och för att registrera de resulterande neurite spår till en referenskolonn array. För det tredje visar vi de datormetoder för att extrahera information om den plana projektionsriktningen och skiktet specifika uppsägning av dendriter, samt för att härleda skattningar för dendritiska förgrening och termineringsfrekvenser. Tillsammans utgör dessa metoder gör det möjligt att karakterisera dendritiska mönster i 3D, klassificeringen av celltyper baserade på dendritiska morfologier, och att identifiera potentiella brister i mutanter.