Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Lichtmikroskopie, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen – Mikroskopie, hat sich als ein wirksames Instrument zur in vivo neuronalen Prozesse zu studieren, unter anderem ^{1, 2.} Obwohl die typische räumliche Auflösung bei der Lichtmikroskopische (LM) Ebene ungefähr 200 nm, die jüngsten technologische Fortschritte sind verschiedene Lichtquellen, wie beispielsweise extremer Ultraviolett- und weiche Röntgenmikroskopie, hat insbesondere diese Auflösung auf eine fast 10 nm räumlichen Auflösung erhöht ^{3 , 4, 5.} Weitere technologische Fortschritte in der bildgebenden Magnetresonanz – Bildgebung umfassen mit der Histologie kombiniert und bieten ein neues Verfahren zur in vivo , die Dicke der Myelinscheide Messen eines Parameters, der traditionell meßbaren nur an der Elektronenmikroskopische (EM) Stufe ^{6, 7} war. Although diese Fortschritte bei der LM-Ebene ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung lebende Prozesse liefern, um eine Detailansicht und Charakterisierung von Strukturen, wie synaptische Kontakte kann nur mit EM erreicht werden, die eine Auflösung bietet, die 0,5 nm erreichen kann. Allerdings Beobachtung bei der EM-Ebene erfordert die Proben in gewisser Weise tot und verändert zu werden, mit chemischen Fixateure und Entwässerungsverfahren, um die Zytoarchitektur zu bewahren. Somit können biologische Proben bei hoher Auflösung der Prüfung herausfordernd aufgrund von Strahlungsschäden des Elektronenstrahls, geringem Kontrast, strukturelle Abweichungen von Membranen oder auch das Vorhandensein von Artefakten , die nach der Dehydratisierung und epoxy auftreten können Einbettung ^{8, 9, 10.}

Die Erhaltung Proben in ihrer nativen Form für die Strukturanalyse kann mit „Cryo EM verglastem Sections“ oder CEMOVIS, mit schneidendem Ansatz erreicht werden, dassbeinhaltet schnell einfrieren und die Probe in Eis glasiger Einbettungs und die Abschnitte unter der EM bei einer kryogenen Temperatur ^{11, 12} zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Proben , während sie noch fester und vollhydratisierte sind, so dass Artefakte , die durch Austrocknung Beseitigung verarbeitet ^13. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren zusätzliche Vorrichtungen für Kryo-Ultramikrotomie, sowie zusätzliche Geräte auf dem Standard-EM, um diese Beobachtung bei sehr niedrigen Temperaturen zu ermöglichen, was erhebliche Mehrkosten erzeugen. Darüber hinaus schließt die CEMOVIS Ansatz die Verwendung von Techniken Immunmarkierung, da Antikörper in der Regel bei RT inkubiert werden müssen. Alternativ ist es möglich, ultrastrukturelle Analyse mit immunhistochemischen Verfahren zu kombinieren, indem eine Gefriert Substitution Ansatz, bei dem Kryo-fixierten Proben langsam aufgetaut werden, während in Cryo-Schutzchemikalien immerged und sind then in Spezialharze eingebettet, wie Lowicryls. Post-Einbettung Immunmarkierung kann dann auf einem solchen Material ¹² durchgeführt werden. Allerdings Gefriersubstitution und Kryo-Fixierung Techniken sind zeitaufwendig. Sie erfordern die Installation zusätzlicher Ausrüstung und erfordern noch Proben zu organischem Lösungsmittel und chemische Fixiermittel ausgesetzt werden, die die Zytoarchitektur verändern können, trotz der Verwendung einer niedrigen Temperatur ^{14, 15.} Daher trotz aller technologischen Fortschritte sowohl bei dem LM und EM – Ebene, chemische Fixierung von Hirngeweben, insbesondere Acrolein, bleibt eine kostengünstige und zeitsparende Methode zu kombinieren Immunhistochemie mit EM ^16.

In den letzten Jahrzehnten wurden viele Versuche unternommen, eine Mischung von Aldehyden zu finden, das die beste Gewebeerhaltung bieten. Vor den 1960er Jahren die einzige Fixiermittel Chemikalie, die akzeptable Ergebnisse für EM gab, war Osmiumtetroxid. Allerdings ist Osmiumtetroxid sehr giftig und teuer, ihre Verwendung durch das Gefäßsystem ausschließen Organe wie das Gehirn zu fixieren. Acrolein wurde in den späten 1950er Jahren als ein zuverlässiges Verfahren für die Tiergewebekonservierung geeignet für EM Beobachtung von Zellstrukturen ¹⁷ eingeführt. Es durchdringt die tiefen Gewebe und reagiert schneller als anderer Aldehyde , wenn zur Fixierung durch Eintauchen verwendet , und ermöglicht eine gute Konservierung zytoplasmatischer Komponenten mit minimaler Schrumpfung des Gewebes ^17. Ein solches Merkmal ergibt Fixierung acrolein einen klaren Vorteil gegenüber anderen Aldehyden in frischem Gewebe bei der Verwendung, durch eine genauere Lokalisierung von lebenden molekulare Verbindungen ermöglichen, wie Enzyme und andere Proteine , ^18. Tatsächlich hat es sich als einfache, effiziente und kostengünstige Methode der Fixierung für Visualisierung an der EM-Ebene in vielen Arten, darunter Amphibien und Nagetiere, wie sie effizient stabili im Laufe der Jahre validiertZES Peptide und Proteine, behalten Antigenität und liefern relativ intakt Ultrastruktur , wenn ¹⁶ in Kombination mit einem anderen Aldehyd Fixativ ^{verwendet, 18, 19, 20, 21.} Protokolle für Acrolein Fixation in Nagetieren seitdem wurden umfassend, vor allem durch die Pickel – Gruppe, zur Umsetzung dual Immunomarkierung für EM ^{16, 22} standardisiert und verwendet. Einige Gruppen haben Acrolein Fixation in nicht-menschlichen Primaten – Hirngewebe ²³ verwendet. Jedoch unser Wissen gibt es nur ein veröffentlichtes Protokoll effizient chemische Fixierung mit Acrolein in nicht-menschlichen Primaten beschreibt , die kompatibel sind mit EM Immunmarkierung ^24.

In diesem Artikel stellen wir eine einfache und zuverlässige Methode effizient chemisch nicht-hum zu behebenein Primaten Gehirne mit Acrolein, so dass für eine potentiell langfristige Konservierung sowie vor Einbettungs Immunomarkierung und Übertragung EM Prüfung.