Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di<em> Clostridium difficile</em> In risposta al trattamento antibiotico
Summary
Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.
Abstract
La valutazione dell'azione antibiotica con il nuovo sviluppo di farmaci verso batteri anaerobici è difficile e tecnicamente esigente. Per ottenere una visione di possibili MOA, i cambiamenti morfologici associati all'esposizione agli antibiotici possono essere visualizzati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). L'integrazione dell'immagine SEM con le curve di uccisione tradizionali può migliorare la nostra comprensione nell'azione dei farmaci e promuovere il processo di sviluppo del farmaco. Per testare questa premessa, le curve di uccisione e gli studi SEM sono stati condotti utilizzando farmaci con noti ma diversi MOA (vancomicina e metronidazolo). Le cellule C. difficile (R20291) sono state coltivate con o senza la presenza di antibiotico fino a 48 ore. Durante l'intervallo di 48 ore, le cellule sono state raccolte in più punti temporali per determinare l'efficacia antibiotica e per l'imaging sul SEM. In linea con le precedenti relazioni, la vankomicina e il metronidazolo avevano un'attività battericida significativa dopo 24 h di trattamento misurata con unità di colonia-formatore (CFU)ting. Utilizzando l'imaging SEM abbiamo determinato che metronidazolo avesse effetti significativi sulla lunghezza delle cellule (> 50% di riduzione della lunghezza cellulare per ogni antibiotico, P <0,05) rispetto ai controlli e alla vankomicina. Mentre la risposta fenotipica al trattamento farmacologico non è stata documentata in precedenza in questo modo, essi sono coerenti con la MOA del farmaco che dimostra la versatilità e l'affidabilità dell'immagine e delle misurazioni e l'applicazione di questa tecnica per altri composti sperimentali.
Introduction
Clostridium difficile è un batterio gram-positivo, che forma spore, causando circa 500.000 infezioni annuali negli Stati Uniti e viene considerato un livello di rischio pericoloso da parte dei centri per la prevenzione e la prevenzione delle malattie (CDC), il livello più elevato di rischio. La decade passata ha visto notevoli sviluppi di farmaci in antimicrobici con attività contro C. difficile . 2 , 3 Studi in vitro sono una componente necessaria del processo di sviluppo del farmaco. 4 Tradizionalmente, in vitro suscettibilità e studi sul tempo sono stati utilizzati per convalidare futuri studi sugli animali e altri in vivo .
Mentre questi metodi servono un ruolo importante per valutare l'azione di uccisione, non catturano la risposta fenotipica delle cellule al trattamento farmacologico. Incorporando la scansione microscopia elettronica (SEM) con standardGli studi cinetici di uccisione, è possibile una caratterizzazione più approfondita degli effetti diretti antibiotici. 5 , 6 , 7 Ecco qui un metodo in cui SEM viene utilizzato come un mezzo per profilare l'efficacia del trattamento antibiotico.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'obiettivo dello studio è stato quello di creare un metodo ad alto throughput per l'isolamento di C. difficile e la prova di suscettibilità antibiotica utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) come mezzo per una caratterizzazione più approfondita dell'azione farmacologica dell'antibiotico. Utilizzando i protocolli descritti qui, abbiamo dimostrato che l'imaging della risposta fenotipica della cellula al trattamento antibiotico può rivelare una visione dell'azione far…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.
Materials
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75x25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
Referências
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
