Generation av iPSC härledda mänskliga hjärnan Organoids till modell Tidig nervsystemets sjukdomar

Mänskliga nervsjukdomar, såsom mikrocefali, bara kan vara dåligt studerats i djurmodeller på grund av det faktum att mänskliga hjärnor har en utökad kortikala ytan, en unik funktion som skiljer sig från icke-mänskliga djur.

Denna aspekt gör mänsklig hjärnans utveckling en komplex process som inte i tillräcklig utsträckning kan studeras i en 2D, in vitro cellodlingssystem. Emerging 3D kulturtekniker tillåter generering av vävnadsliknande organoids från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). In vitro differentiering av pluripotenta stamceller i en 3D-suspensionskultur medger bildning av olika celltyper i tid och region-specifikt sätt, vilket ger upphov till en organiserad, skiktad vävnad ^{1, 2, 3.} Tack vare laboratorier som banade väg 3D odlingstekniker och avmystifierad komplexiteten av organbildning, med utgångspunkt från stamceller,vi utvecklat en robust metod för att generera hjärn organoids att avgränsa tidiga händelser av mänsklig hjärnans utveckling och att modellera mikrocefali in vitro ^{1, 2, 3.} Det är anmärkningsvärt att vi anpassat den ursprungliga metod som utvecklats av Lancaster et al. att generera cerebrala organoids ^1. Denna metod modifierades enligt våra experimentella krav.

Syftet med en studie från Gabriel et al. var att analysera de cellulära och molekylära mekanismer för neural stamcell underhåll under hjärnans utveckling. För att göra detta genomfördes en mekanistisk studie utförd genom att analysera neurala progenitorceller (NPC) i 3D hjärn organoids härledda från en mikrocefali patienten ^4. Denna patient genom en mutation i CPAP, en konserverad centrosomal protein som krävs för centrosom biogenes ^5. En allmänt accepterad hypotes är att mikrocefali är resultatet av en utarmning av NPC pool, och detta kan bero antingen på celldöd eller till för tidig differentiering ^{1, 6, 7, 8, 9.}

Genom att analysera de ventrikulära zoner (VZs) av mikrocefali hjärn organoids, visades det att ett betydande antal NPC genomgå asymmetrisk celldelning, till skillnad från hjärn organoids härledda från en frisk givare ^4. Omfattande mikroskopiska och biokemiska analyser av microcephalic hjärn organoids avslöjade en oväntad roll för CPAP i rätt tid cilier demontering ^4. Specifikt, är muterad CPAP associerad med retarderad cilium demontering och fördröjd cellcykel återinträde, vilket leder till för tidig differentiering av NPC ^4. Dessa resultat tyder på en roll för cilier i mikrocefali och thEIR engagemang under neurogenes och hjärnstorlek kontroll ^10.

Den första delen av detta protokoll är en beskrivning av en trestegsmetod för att generera homogena hjärn organoids. Som tidigare nämnts, var den ursprungliga Lancaster protokollet anpassas och modifieras för att passa vårt syfte ^en. Först, mänskliga iPSCs odlas i ett definierat matare fritt tillstånd på Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matris. Detta steg undviker variationer av matarberoende pluripotenta stamcellkulturer. I detta protokoll för att induktion av neural differentiering bilda neural epitel börjar direkt från iPSCs. Genom att hoppa över embryoid kropp (EB) bildningssteget, de neurala differentieringsfortskrider i en mer kontrollerad och riktad sätt. Detta tillvägagångssätt begränsar spontan och oriktade bildandet av andra könscellsskikt, såsom mesoderm och endoderm. Genom att tillämpa detta protokoll, kan neurosfärer som innehåller neurala rosetter skördas på dag 5 för EHS matris inbäddning och stationär suspensionsodling. Den organoid medium som används för det tredje steget i våra protokoll kompletteras med dorsomorphin och SB431542. Dorsomorphin är en liten-molekyl hämmare av benmorfogent protein (BMP), och SB431542 hämmar TGFp / aktivin / nodal signalväg. Kombinationen av dessa faktorer skulle kunna främja neural differentiering mer effektivt än retinsyra ensam ^{11, 12, 13, 14.}

Helt och hållet, dessa modifieringar möjliggöra reproducerbar alstring av hjärn organoids, med minimala variationer mellan organoids. Viktigare, var detta förfarande appliceras på robust generera microcephalic hjärn organoids från patientens iPSCs, som bär mutationer i gener som påverkar centrosomer och cellcykel dynamik.

Den andra delen av detta protokoll ger instruktioner för att förbereda brain organoids för analys och tolkning av cellulära defekter i mikrocefali. Detta inkluderar fixering, cryosectioning, immunofluorescerande färgning, och konfokal mikroskopanalys. Detta protokoll kommer att ge läsaren en detaljerad beskrivning av de förväntade resultaten och vägledning för tolkning.