جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر
Summary
Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.
Abstract
The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.
Introduction
اضطرابات النمو العصبي الإنسان، مثل صغر الرأس، لا يمكن إلا أن تدرس بشكل سيئ في النماذج الحيوانية يرجع ذلك إلى حقيقة أن العقول البشرية لديها سطح القشرة الموسعة، وهي ميزة فريدة من نوعها مختلفة من الحيوانات غير البشرية.
هذا الجانب يجعل نمو الدماغ الإنسان عملية معقدة لا يمكن دراستها بشكل كاف في 2D، في نظام زراعة الخلايا في المختبر. الناشئة تقنيات زراعة 3D تسمح توليد organoids مثل الأنسجة من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs). تمايز في المختبر من خلايا جذعية المحفزة في ثقافة تعليق 3D يسمح بتشكيل مختلف أنواع الخلايا في الوقت المناسب وبطريقة منطقة محددة، مما أدى إلى والأنسجة المنظمة الطبقية 1، 2، 3. بفضل المختبرات التي كانت رائدة تقنيات ثقافة 3D وبسط تعقيد تشكيل الجهاز، بدءا من الخلايا الجذعية،قمنا بتطوير وسيلة قوية لتوليد organoids الدماغ لتحديد الأحداث في وقت مبكر من نمو الدماغ البشرية ونموذج صغر الرأس في المختبر 1، 2، 3. ومن الجدير بالذكر أننا تكييف طريقة الأصلي التي وضعتها لانكستر وآخرون. لتوليد organoids الدماغي 1. تم تعديل هذه الطريقة وفقا لمتطلبات التجريبية لدينا.
والهدف من دراسة من جبريل وآخرون. كان لتحليل الآليات الخلوية والجزيئية من العصبية صيانة الخلايا الجذعية أثناء نمو المخ. من أجل القيام بذلك، وقد أجريت دراسة الآلية عن طريق تحليل الخلايا الاولية العصبية (الشخصيات) في organoids الدماغ 3D المستمدة من المريض صغر الرأس (4). حمل هذا المريض طفرة في CPAP، وهو بروتين centrosomal الحفاظ اللازمة لنشوء حيوي الجسيم المركزي 5. A فراش لا تسبب مقبولة على نطاق واسعالأطروحة هو أن صغر الرأس هو نتيجة لنضوب حوض السباحة مجلس الشعب، وهذا قد يكون راجعا إما إلى موت الخلية أو التمايز من السابق لأوانه 1 و 6 و 7 و 8 و 9.
من خلال تحليل مناطق البطين (VZs) من organoids الدماغ صغر الرأس، تبين أن عددا كبيرا من الشخصيات الخضوع لانقسام الخلايا غير متناظرة، على عكس organoids الدماغ مشتقة من متبرع سليم (4). وكشفت التحليلات المجهرية والكيمياء الحيوية واسعة من organoids الدماغ صغر الرأس دورا غير متوقع لCPAP في أهداب في الوقت المناسب التفكيك 4. على وجه التحديد، ويرتبط CPAP تحور مع التفكيك هدب المتخلفين وتأخر دورة الخلية اعادة الدخول، مما يؤدي إلى تمايز سابق لأوانه من الشخصيات 4. وتشير هذه النتائج دور للأهداب في صغر الرأس والعشرينمشاركة الاستخراجية خلال تكوين الخلايا العصبية وحجم الدماغ السيطرة على 10.
الجزء الأول من هذا البروتوكول هو وصف لطريقة من ثلاث خطوات لتوليد organoids الدماغ متجانسة. كما ذكرت من قبل، تم تكييفها على بروتوكول لانكستر الأصلي وتعديلها لتتناسب مع هدفنا 1. أولا، iPSCs البشرية المستزرعة في حالة محددة خالية من التغذية على Engelbreth-هولم-سرب (EHS) المصفوفة. هذه الخطوة يتجنب الاختلافات المحفزة مزارع الخلايا الجذعية التي تعتمد على التغذية. في هذا البروتوكول، وتحريض التمايز العصبي لتشكيل الظهارة العصبية تبدأ مباشرة من iPSCs. من خلال تخطي الخطوة تشكيل هيئة مضغي (EB)، عائدات التمايز العصبية بطريقة أكثر رقابة وموجهة. هذا النهج يحد من تشكيل عفوية وصليات من طبقات الخلايا الجرثومية الأخرى مثل الأديم المتوسط والأديم الباطن. من خلال تطبيق هذا البروتوكول، neurospheres تحتوي على ريدات العصبية يمكن أن تحصد في يوم 5 لEHS تضمين المصفوفة وثقافة تعليق ثابتة. وتستكمل المتوسط عضوي الشكل المستخدمة في الخطوة الثالثة من بروتوكول لدينا مع dorsomorphin وSB431542. Dorsomorphin هو المانع جزيء صغير من البروتين morphogenic العظام (BMP)، وSB431542 يمنع TGFβ / activin / العقدي مسار الإشارات. مزيج من هذه العوامل يمكن أن تعزز التمايز العصبي أكثر كفاءة من حمض الريتينويك وحده 11 و 12 و 13 و 14.
وإجمالا، تمكن هذه التعديلات الجيل استنساخه من organoids الدماغ، مع الحد الأدنى من الاختلافات عبر organoids. الأهم من ذلك، تم تطبيق هذه الطريقة لتوليد بقوة organoids الدماغ صغر الرأس من iPSCs المرضى، والتي تحمل طفرات في الجينات التي تؤثر جسيم مركزي وديناميات دورة الخلية.
الجزء الثاني من هذا البروتوكول يعطي تعليمات لإعداد رعين organoids لتحليل وتفسير العيوب الخلوية في صغر الرأس. وهذا يشمل التثبيت، cryosectioning، تلوين مناعي، والتحليل المجهري متحد البؤر. وهذا البروتوكول توفر للقارئ وصفا مفصلا للنتائج المتوقعة ومع التوجيه للتفسير.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCPH هو اضطراب النمو العصبي البشري المعقد الذي لا يمكن تلخيصها في النماذج الحيوانية في الجسم الحي أو في نهج بسيطة زراعة الخلايا البشرية في المختبر. مظهر من مظاهر السريرية للMCPH يبدأ في الظهور خلال الأشهر الثلاثة الأولى، عندما يبدأ في وقت مبكر الخلايا العصبية. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة تايسن فريتز (Az.10.14.2.152). ونحن ممتنون للمنشأة تضمين الأنسجة ومرفق المجهر جوهر CMMC. ونحن ممتنون للمناقشات والدعم الفني المقدم من أعضاء مختبر الجسيم المركزي والهيكل الخلوي علم الأحياء. نشكر لي مينغ GOOI لتنقيح الكتابة المخطوطة.
Materials
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 ml | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
Referências
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome?. Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D’Avanzo, C., et al. Alzheimer’s in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
