Controllabile Espressione Ion Canale attraverso inducibile trasfezione transiente

Esprimendo eterologhi sistemi è una delle tecniche più utilizzate per studiare un gran numero di funzioni cellulari ^1. Il loro profilo basso endogena di proteine, minima necessità di manutenzione, la crescita affidabile, e la capacità di intraprendere e di esprimere DNA estraneo hanno fatto linee cellulari quali embrionale umano Rene (HEK293) e ovaio di criceto cinese (CHO) quasi indispensabile per la ricerca biologica ^{2, 3.} Le aree di ricerca che utilizza sistemi eterologhi includono proteine ​​di membrana, di segnalazione intracellulare, e l'attività enzimatica. A seguito di trasfezione di DNA estraneo all'interno della cellula, molte diverse forme di analisi possono essere eseguite, tra cui elettrofisiologia, l'imaging del calcio raziometrico, Western Blot, ecc ^{4, 5.}

A causa della vasta gamma di potenziali applicazioni per i sistemi di espressione eterologa, molti differereagenti e prodotti nt sono stati sviluppati per utilizzare queste cellule e le loro qualità ^6. sistemi di consegna del DNA che si integrano in modo transitorio o permanente DNA estraneo nelle cellule per studiare proteina esogena è diventato uno degli strumenti più popolari e utili per la ricerca biologica. Più specificamente, transitoriamente trasfezione del DNA in una cellula è ampiamente usato come un semplice processo avanti, rettilineo che richiede relativamente poco tempo e materiali. Inoltre, il tasso di successo di cellule che subiscono trasfezione è alto ^7. Questa tecnica è molto affidabile quando combinato con un gene marcatore come proteina fluorescente verde (GFP), e può essere utilizzato per diverse tecniche come l'imaging calcio e elettrofisiologia ^5. Purtroppo, però, esprimono transitoriamente DNA nelle cellule ospiti viene fornito con alcune importanti insidie, non in meno che il livello di espressione per cellule è inaffidabile. Il numero di copie di DNA plasmidico taken up per cella è incontrollabile, quindi l'espressione tra i singoli esperimenti può variare notevolmente ^2. Questo problema diventa significativo quando uno tenta di replicare le condizioni fisiologiche, o l'esecuzione di precise tecniche di raccolta dei dati.

Come soluzione a complicazioni menzionati sopra, i protocolli di trasfezione stabili sono stati progettati in cui un gene di interesse può essere inserito nel genoma di una cellula sotto stretto controllo di un promotore inducibile, ad esempio un sistema tetraciclina repressore espressione, assicurando una singola copia del plasmide integra nel genoma di ciascuna cella e viene espresso solo dopo l'induzione del meccanismo di trascrizione, per esempio, in presenza di doxiciclina. Mentre questo risolve gli ostacoli di livelli di espressione proteica incoerenti, questo metodo perde la comodità di protocollo rapido e relativamente semplice trasfezioni transitorie. Stabilire una linea cellulare stabile richiede almeno un paio di settimane in which si deve calibrare una curva di uccisione fissato antibiotici specifici per mantenere l'espressione proteica e garantire l'integrazione del vettore e abilmente selezionare e crescere colonie di cellule. Nel complesso questo richiede molto più tempo e fatica con un tasso di successo più bassa ^8.

Qui, vi presentiamo un protocollo intermedio che si basa sui punti di forza di entrambe le opzioni di trasfezione popolari per fornire un modo semplice ed efficace per controllare i livelli di espressione in qualsiasi linea cellulare inducibile. Pur mantenendo le cellule con un sistema tet inducibile, abbiamo transitoriamente trasfezione nostro gene di interesse, Transient Receptor Potential canale cationico membro sottofamiglia V 1 (TRPV1), legatura in un vettore che può homologously coniugare con il sistema repressore. In questo modo, il gene può essere introdotto nelle cellule senza cominciando a esprimere. Solo con l'aggiunta di doxiciclina non gene comincia a esprimere, ci permette di calibrare i livelli di proteine ​​exprESSIONE secondo la tecnica o livelli osservati in condizioni fisiologiche. Il nostro protocollo evita anche complicanze lunghe associati con la generazione di una linea cellulare che esprime stabilmente. Iniziamo mostrando i livelli mutevoli di attivazione TRPV1 nella diagnostica per immagini del calcio da un-indotta attraverso quattro ore di induzione e come l'aumento dei livelli intracellulari di calcio correlato. Abbiamo quindi duplicare il protocollo in tutta la configurazione della cella della tecnica del patch clamp, mostrando l'attuale aumento con il tempo di induzione crescente. Infine, vi presentiamo alcuni esempi di registrazioni elettrofisiologiche singoli canali, e dimostrare che questa tecnica è particolarmente utile per espressione controllata quando alla ricerca di raccolta di dati precisi sulla base di singole unità della proteina. Attraverso il nostro protocollo, offriamo un modo comodo per controllare l'espressione della proteina in sistemi eterologhi, evitando lunghe complicazioni di coltura cellulare, fornendo così un modo per controllare le condizioni tra esperimenti e fornire mori risultati replicabili.