Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로
Summary
Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.
Abstract
Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC), 신경 그리고 glial 세포의 형태학 적 및 기능적 특성은 잘 보존 된. 이 모델은 neuroprotection, 뉴런, 신경 네트워크 또는 종양 침입에 electrophysiological 실험 연구를 포함 하는 다양 한 연구 질문을 해결 하는 데 적합 합니다. Hippocampal 건축과 multisynaptic 회로에 신경 활동은 잘 보존 OHSC, 비록 조각화 절차 자체가 처음 병 변 및 glial 흉터의 형성에 이르게. 흉터 형성 아마도 기계적 특성 및 작은 분자, 등의 방산 동작을 변경합니다. 분할 영역 동물 수술, 그리고 다양 한 두뇌 파생 된 셀 형식, 즉 이다, microglia 및 생리 적 및 병 적인 모두에서 뉴런 간의 상호 작용에 대 한 연구 없이 뇌 손상 후 시간 종속 프로세스의 모니터링 허용 조건입니다. 이 모델의 상반 된 측면 혈 및 면역 혈의 부재 이다. 신경 손상의 진행 하는 동안 혈액 재생 중요 한 역할에서에서 면역 세포를 마이그레이션. 그 셀은 조각에, 문화에 본질적인 프로세스 외부 간섭 없이 관찰 될 수 있습니다. 또한, OHSC에서 중간 외부 환경의 구성 정확 하 게 제어 됩니다. 이 방법의 더 이점은 표준 준비에 비해 희생된 동물의 낮은 수입니다. 몇몇 OHSC는 가능한 한 동물에서 여러 치료와 동시 연구를 만드는 하나의 동물에서 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로, OHSC는 조직 손상 후 또는 종양 침공 기간 동안 새로운 보호 치료제의 효과 분석 하는 데 적합.
제시 하는 프로토콜 여기 매우 재현할 수 생성을 허용 하는 OHSC의 준비 방법에 설명 합니다, 그리고 잘 neuroprotection 또는 종양 침입 연구 처럼 실험적인 연구의 다양 한 사용할 수 있는 분할 영역을 보존.
Introduction
OHSC는 공부 microglia1, 이다 및 신경 세포의 생리 및 병 적인 속성을 잘 특징이 생체 외에서 모델입니다. Extracellular 환경을 제어 하 고 다양 한 자극 후 셀룰러 및 형태학 상 변화를 모니터링 하는 것이 쉽습니다. Hippocampal 신경의 조직 및 그들의 연결 준비2,3후 잘 보존 되어 있습니다. 여러 장점 중 OHSC 동물 수술 없이 뇌 상해와 종양 내 습의 모니터링 하실 수 있습니다. 6 ~ 8 OHSC 단일 설치류 두뇌에서 얻어질 수 있다. 크게 동물의 수를 줄이고 같은 동물에 여러 약물 농도, 유전자 조작 또는 다른 병 변 모델을 테스트 허용 OHSC 따라서 도움이 될. 분할 영역 기반 분석 실험에서 실험 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 또한, 보조 손해 같은 병 적인 상태의 시간 종속 개발 시간 경과 영상에 의해 쉽게 모니터링할 수 있습니다.
Stoppini 그 외 여러분 에 의해 원래 설립 주어진된 프로토콜에서 4, 준비 단계는 설명 하 고 적절 한 조각의 선택에 대 한 중요 한 형태학 랜드마크 강조 표시 됩니다. 생 후 7-9 일 쥐 또는 산 후 4-5 일 쥐의 준비를 좋습니다. 이 기간에서 OHSC 기계적 충격 및 신경 회로의 개편을 위한 높은 잠재력에 강력한 저항을 표시. 반면, 배아 또는 성인 쥐에서 준비 급속 하 게 그들의 구조를 변경 재배 하는 동안 그들의 organotypic 형태를 잃고 고 따라서 덜 공부 하는 기초 연구5,6 장기 프로세스에 적합 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. OHSC의 생존 율에 대 한 또 다른 중요 한 포인트 확산 및 따라서 영양소 공급은 제한 된12,,1314조각 자체의 두께입니다.
Protocol
에 의해 유럽 공동체 위원회 지침 2010/63/EU 유럽 의회의 승인으로 동물 실험 윤리 정책 및 신경 과학 연구에 있는 동물의 사용에 정책에 따라 수행 했다 고 과학적 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 유럽 연합의 위원회. 1. 준비의 악기와 문화 미디어 OHSC의 준비에 대 한 사용의 다음 세트: 2 개의 작은 위, 두 곡선된 핀셋, 좋은 팁, 한 트위터 (크기 11, 하나 크기 15의 2)…
Representative Results
Neuroprotection 연구: 신경 손상, PI 긍정적인 핵과 IB4 가 이랑 (DG)의 립 세포 층 (GCL)의 모든 3 광학 섹션에서 microglia 계산 했다 긍정적인의 수를 결정 합니다. 종양 내 습 실험, 스택의 최대 강도 z 프로젝션 계산 침략의 다른 침입 패턴 (그림 6)를 시각화 하는 측정으로 종양 세포에 의해 커버 된 지역에 대 한 사용 되었습니다. <p clas…
Discussion
현재 프로토콜 OHSC의 준비를 설명합니다. 이 모델은 내장 기능 및 뇌 조직의 반응의 생리 및 병리학 자극의 적용 후 테스트 수 있습니다. Electrophysiological 매개 변수 분석, 외 OHSC lesioned 수와 모든 세포 유형에 손상의 효과 확인할 수 있습니다. 다른 물질 및 lesioning 프로세스 또는 대 식 세포와 림프 톨의 부재에서 치유의 자세한 설명과 함께 치료 가능 하다.
The most 중요 한 단계?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 크리스틴 Auste 그의 우수한 기술 지원에 대 한 비디오 녹화 및 종합 Ghadban 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. Urszula Grabiec 루 프로그램 FKZ 29/18에 의해 지원 되었다.
Materials
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
Referências
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. . New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neurociência. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neurociência. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ‘ unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
Citar este artigo
Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer, N., Dehghani, F. Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (126), e55359, doi:10.3791/55359 (2017).