Organotypic hippocampus skive kulturer (OHSC) repræsenterer en in vitro- model, der simulerer i vivo situationen meget godt. Her beskriver vi en vibratome-baseret forbedret udskæring protokol for at opnå høj kvalitet skiver til brug ved vurderingen af neuroprotektive potentiale af nye stoffer eller den biologiske opførsel af tumorceller.
I organotypic hippocampus skive kulturer (OHSC) er de morfologiske og funktionelle egenskaber af neuroner og gliaceller velbevaret. Denne model er velegnet til at håndtere forskellige forskningsspørgsmål, der involverer studier på neuroprotection, elektrofysiologiske eksperimenter på neuroner, neuronal netværk eller tumor invasion. Hippocampus arkitektur og neuronal aktivitet i multisynaptic kredsløb er godt bevaret i OHSC, selv om proceduren udskæring for sig selv i første omgang læsioner og fører til dannelsen af et glial ar. Ar-dannelse ændrer formentlig de mekaniske egenskaber og diffuserende opførsel af små molekyler, osv. Skiver tillader overvågning af tid brugerafhængige processer efter hjerneskade uden dyr operation, og studier på interaktioner mellem forskellige hjerne-afledte celletyper, nemlig astrocytter, mikroglia og neuroner under både fysiologiske og patologiske betingelser. En ambivalent aspekt af denne model er manglen på blodgennemstrømningen og blod immunceller. Under progression af neuronal skade, du overflytter immunceller fra blod spiller en vigtig rolle. Da disse celler er mangler i skiver, kan de iboende processer i kulturen ses uden indblanding udefra. Desuden i OHSC er sammensætning af medium-eksterne miljø netop kontrollerede. En yderligere fordel ved denne metode er det lavere antal ofrede dyr i forhold til standard præparater. Flere OHSC kan være fremstillet af et dyr at samtidige studier med flere behandlinger i ét dyr muligt. Af disse grunde OHSC er velegnede til at analysere virkningen af nye beskyttende therapeutics efter vævsskader eller under tumor invasion.
Protokollen præsenteret beskriver her præparationsmetode af OHSC, der tillader generere meget reproducerbar, velbevaret skiver, der kan bruges til en række forskellige eksperimentelle forskning, ligesom neuroprotection eller tumor invasion undersøgelser.
OHSC er et godt karakteriseret i vitro model til at studere både fysiologiske og patologiske egenskaber af neuroner, astrocytter og mikroglia1. Det er let at kontrollere det ekstracellulære miljø og overvåge de cellulære og morfologiske forandringer efter forskellige stimuli. Organisation af hippocampus neuroner og deres forbindelser er velbevaret efter forberedelse2,3. Ud af flere fordele, OHSC giver mulighed for overvågning af hjernen skade og tumor invasion uden animalske kirurgi. Seks til otte OHSC kan fås fra en enkelt gnaver hjerne. OHSC derfor bidrage til at reducere antallet af dyr og tillade afprøvning flere stof koncentrationer, genetiske manipulationer og forskellige læsion modeller i de samme dyr. I Skive-baserede assays, kan forsøgsbetingelser styres nøjagtigt. Derudover tid afhænger af udviklingen af patologiske tilstande som sekundære skader kan nemt overvåges af time-lapse billeddannelse.
I den givne protokol, oprindeligt etableret af Stoppini et al. 4, Forberedelsestrinnene er beskrevet og vigtige morfologiske vartegn for udvælgelsen af relevante skiver er fremhævet. Vi anbefaler fremstilling af postnatal dag 7-9 rotter eller postnatal dag 4-5 mus. I disse perioder viser OHSC en robust resistens over for mekanisk traumer og et stort potentiale for reorganisering af neuronal kredsløb. Derimod præparater fra embryonale eller voksne rotter hurtigt ændre deres struktur og mister deres organotypic morfologi under dyrkning og er derfor mindre egnet til at studere langsigtede processer i grundforskning5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. et andet kritisk punkt for overlevelsesraten for OHSC er tykkelsen af udsnittet, selv som diffusion og dermed næringsstofforsyning er begrænset12,13,14.
Denne protokol beskriver forberedelse af OHSC. Denne model giver mulighed for afprøvning af iboende evner og reaktioner af hjernevæv efter anvendelse af fysiologiske og patologiske stimuli. Ud over analyser af elektrofysiologiske parametre, OHSC kan være lesioned og virkningerne af skader på alle celletyper kan bestemmes. Behandling med forskellige stoffer og den detaljerede beskrivelse af lesioning processer eller healing i mangel af makrofager og lymfocytter er muligt.
The most kritiske …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Christine Auste for hendes støtte med video-optagelse og Chalid Ghadban for hans fremragende teknisk bistand. Urszula Grabiec blev støttet af Roux Programm FKZ 29/18.
6-Well | Falcon | 35-3046 | |
Agar | Fluka | 5040 | |
Autoclav | Systec | DX-45 | |
CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
Glucose | Merk | 1083371000 | |
Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
U138 | ATCC | HTB-14 | |
Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |