Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais
Summary
Culturas de fatias hippocampal organotypic (OHSC) representam um modelo in vitro que simula a situação na vivo muito bem. Aqui descrevemos uma vibratome de base melhorada fatiar protocolo para obter fatias de alta qualidade para uso em avaliar o potencial neuroprotetor do romance substâncias ou o comportamento biológico das células tumorais.
Abstract
Em culturas hippocampal fatia de organotypic (OHSC), as características morfológicas e funcionais dos neurônios e células gliais estão bem conservadas. Este modelo é apropriado para abordar questões de pesquisa diferentes que envolvem estudos na neuroproteção, eletrofisiológicos experiências em neurônios, redes neuronais ou invasão do tumor. A arquitetura hippocampal e atividade neuronal em circuitos multisynaptic estão bem conservados em OHSC, mesmo que o próprio procedimento corte inicialmente lesões e leva à formação de uma cicatriz glial. A formação de cicatriz presumivelmente altera as propriedades mecânicas e comportamento difusiva de pequenas moléculas, etc. Fatias de permitam o monitoramento de processos dependentes de tempo após a lesão cerebral sem cirurgia animal e estudos sobre interações entre vários tipos de células derivado do cérebro, ou seja, astrócitos, micróglia e neurônios sob fisiológicos e patológicos condições. Um aspecto ambivalente deste modelo é a ausência de fluxo sanguíneo e as células imunes do sangue. Durante a progressão da lesão neuronal, migração de células do sistema imunológico da peça sangue um papel importante. Como essas células estão falta em fatias, os processos intrínsecos da cultura podem ser observados sem interferência externa. Além disso, em OHSC a composição do ambiente externo médio é precisamente controlada. Uma vantagem adicional desse método é o menor número de animais sacrificados, em comparação com preparações padrão. Vários OHSC pode ser obtido de um animal, possibilitando estudos simultâneos com vários tratamentos em um animal. Por estas razões, OHSC são adequados para analisar os efeitos das novas terapias protetora após dano tecidual ou durante a invasão do tumor.
O protocolo apresentado aqui descreve um método de preparação de OHSC que permite gerar altamente reprodutível, bem preservado fatias que podem ser usadas para uma variedade de pesquisa experimental, como estudos de invasão de neuroproteção ou tumor.
Introduction
OHSC é um modelo bem caracterizadas em vitro para estudar propriedades fisiológicas e patológicas dos neurônios, astrócitos e microglia1. É fácil de controlar o ambiente extracelular e monitorar as mudanças morfológicas e celulares após vários estímulos. A organização dos neurônios hippocampal e suas conexões estão bem conservadas após preparação2,3. Fora várias vantagens, OHSC permitem o monitoramento da invasão de lesão e tumor cerebral sem cirurgia animal. Seis a oito OHSC pode ser obtido de um único cérebro de roedor. OHSC, portanto, ajudar a significativamente reduzir o número de animais e permitir testes várias concentrações de droga, manipulações genéticas ou modelos de lesão diferentes no mesmo animal. Fatia com base em ensaios, em condições experimentais podem ser precisamente controladas. Além disso, desenvolvimento dependente do tempo de condições patológicas como danos secundários facilmente pode ser monitorado pela imagem latente de lapso de tempo.
No protocolo determinado, originalmente estabelecido por Stoppini et al 4, as etapas de preparação são descritas e destacam-se importantes marcos morfológicos para a seleção de fatias apropriadas. Recomendamos a preparação de pós-Natal dia 7-9 ratos ou camundongos pós-Natal dia 4-5. Nesses períodos, OHSC mostram uma resistência robusta de traumas mecânicos e um elevado potencial para a reorganização dos circuitos neuronais. Em contraste, preparações de ratos embrionários ou adultos rapidamente mudam sua estrutura e perdem sua morfologia de organotypic durante o cultivo e, portanto, são menos adequadas para o estudo de processos a longo prazo em investigação básica5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. outro ponto crítico para a taxa de sobrevivência de OHSC é a espessura da fatia em si, como a difusão e, portanto, o fornecimento de nutrientes são limitadas12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente protocolo descreve a preparação de OHSC. Esse modelo permite que o teste de recursos intrínsecos e reações do tecido cerebral após a aplicação de estímulos fisiológicos e patológicos. Além de análises de parâmetros eletrofisiológicos, OHSC pode ser lesado e os efeitos de dano em todos os tipos de células podem ser determinados. Tratamento com substâncias diferentes e a descrição detalhada dos processos de maciços ou na ausência de macrófagos e linfócitos de cura é possível.
<p clas…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a Christine Auste o seu apoio com a gravação de vídeo e Chalid Ghadban por sua excelente assistência técnica. Urszula Grabiec foi apoiada pelo Roux Programm FKZ 29/18.
Materials
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
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