Magneetroerder werkwijze voor de detectie van<em> Trichinella</em> Larven in Muscle Samples

1. Voorbereidingen monstername Opmerking: De magneetroerder methode kan worden gebruikt voor een of spier samengevoegde monsters. Verzamel monsters uit de juiste voorliefde sites en in een passend bedrag 9. Raadpleeg de eisen land of aan de aanbevelingen van ICT, OIE of ISO. Voor de Europese Unie, bijvoorbeeld, neem een ​​1 g monster van een diafragma pilaar bij de overgang van spier naar pees van tamme varkens. Zorg ervoor dat alle spieren monsters zijn vrij van alle vet en fascia. Als de tong wordt getest, verwijdert de oppervlaktelaag voorafgaand aan het testen. Pas op als monsters worden bevroren, omdat de meeste Trichinellalarven niet bestand zijn bevriezen en afwikkelen na de dood, zijn minder bestand tegen de spijsvertering en hebben de neiging vast te houden aan de container muren, wat resulteert in verminderde gevoeligheid van de test. Opmerking: Indien bevroren, het dubbele van de steekproefgrootte op loosten en verhoging van de sedimentatie (zie hieronder). Voorbereiding van de spijsvertering vloeistof Voeg 25% HCl (16 ± 0,5 ml) tot 2 liter leidingwater voorverwarmd tot 46-48 ° C in een 3 L glazen beker. Te lage temperatuur leidt tot onvolledige vertering; te hoge temperatuur deactiveert de enzymatische eigenschappen van pepsine. Plaats een roerstaafje in de beker en roer de oplossing op een voorverwarmd bord (46-48 ° C). Voeg 10 ± 0,2 g pepsine (1: 10.000 NF, 1: 12.500 BP, 2000 FIP) aan de zure oplossing. Opmerking: De kwaliteit van de pepsine is van het allergrootste belang is en enzymactiviteit moet worden gecertificeerd door de producent. Om laboratorium veiligheidsredenen en om de pepsine activiteit te behouden, moet de volgorde van het toevoegen van digestievloeistof componenten worden nageleefd. Muscle monstervoorbereiding Hak tot 100 g van de spier monsters in een blender of molen. Om blen vergemakkelijkending, voeg 2 ml voorverwarmd water aan de monsters en mix op max snelheid 2-3 s. Voordat de tweede mengen, opent u de blender en overdragen spier monster aan de top van het mengen kom rand marge aan de onderkant en herhaal mengen. Blijven mengen met uitbarstingen van 2-3 s tot er geen zichtbare stukjes vlees blijven. Opmerking: Te weinig vermenging kan leiden tot onvolledige spijsvertering, terwijl te veel mengen de larven aanwezig Trichinella in de monsters 6 kunnen beschadigen. 2. Procedure Muscle monsterontsluiting Transfer 1 L van de digestievloeistof in een cilinder. Breng de gemalen vlees in de beker en te verspreiden bij de vertering vloeistof met een lepel of vork. Spoel de mixer deksel blade mixer kom met 500 ml van de voorverwarmde digestie fluïdum in de 3 L bekerglas. Opmerking: Onvolledige spoelen kan resulteren in het verlies van sensItivity. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie en houdt een constante temperatuur van 44-46 ° C en monitor met een thermometer. Roer de digestievloeistof 30 minuten tot een diepe draaikolk zonder spatten ontstaat tot het vlees deeltjes verdwijnen. Afhankelijk van het soort vlees getest (bv vlees van wilde dieren), verhogen de vertering tijd tot een maximum van 60 minuten. Filtratie en sedimentatie van de digestievloeistof Om de hoeveelheid onverteerd weefsel vast te stellen, de omvang op nul, wegen de zeef voor gebruik, en noteer het gewicht. De zeef moet schoon en vrij van elk weefsel deeltjes, die de Trichinellalarven het bereiken van de sedimentatie trechter kunnen belemmeren. Controleer of de scheiding trechter verticaal wordt genivelleerd. Na de vertering, giet de digestievloeistof door een 180 urn zeef in een scheiding glas trechter. De breedte van de scheiding glas trechter mag niet be groter dan 55% van de lengte larve goede sedimentatie mogelijk. Zorg ervoor dat eventuele overflow te voorkomen. Om verlies van de gevoeligheid te voorkomen, spoel het bekerglas en de zeef met ongeveer 200 ml leidingwater uit een squeeze wassen fles en breng het spoelwater in de sedimentatie glas trechter. Zorg zorgvuldig spoelen de randen van de 3 L bekerglas. Til de zeef en het gebied afspoelen onder de zeef grondig. Bepaling van onverteerd weefsel bedrag Opmerking: Als gevolg van fouten in de uitvoering van de werkwijze kan spierweefsel op de zeef blijft, en fascia en bindweefsel onverteerbaar zijn. De hoeveelheid van onverteerd weefsel wordt bepaald gedurende de eerste 10 min sedimentatiestap (zie 2.5). Dit maakt ongeveer 30 minuten voor de zeef droog, het restwater het vastgestelde gewicht van de onverteerd weefsel kan beïnvloeden. Plaats een papieren handdoek op een schaal, en wegen van de zeef met de undigested weefsels. Trek de zeef gewicht vóór filtratie uit de zeef gewicht met onverteerd weefsels. Het verteringsproces als voldoende beschouwd indien niet meer dan 5% van het uitgangsgewicht van de zeef (dat wil zeggen 5 g / 100 g uitgangsmateriaal) blijft. Als de hoeveelheid onverteerd weefsel 5% overschrijdt, herhaal de test met verse spier monsters. Als het restmateriaal hoofdzakelijk bestaat uit onverteerd spierweefsel en verse monsters beschikbaar zijn, verteren het onverteerde resten telkens onderzoeken aanvulling op de oorspronkelijke monsters. Sedimentatie van de digestievloeistof Houd de gefilterde digestievloeistof in de scheitrechter gedurende 30 minuten. Als ongemoeid gelaten, zal de Trichinellalarven bezinken op de bodem van de trechter. Indien bevroren monsters worden gebruikt, verhogen de sedimentatie tijd maximaal 60 minuten. Zodra sedimentatie is voltooid, wordt de kraan volledig openvan de scheitrechter te laten ten minste 40 ml van de digestievloeistof snel af in een bekerglas (80 ml als spier monsters die eerder bevroren was geweest). Allereerst de helft van de vloeistof in de cilinder en vervolgens de kraan volledig open in tegengestelde richting 10 ml digestievloeistof laten passen. Tenslotte opent de kraan in de tegengestelde richting nog 10 ml. Deze procedure garandeert dat Trichinellalarven niet worden gevangen in de kraan. Opmerking: voldoende snelheid vereist om nog in de scheitrechter larven te voorkomen, verminderen gevoeligheid. Sedimentatie van de vertering fluïdum in de cilinder Laat het sediment in de cilinder gedurende 10 minuten om larven te sedimenteren. Verwijder 30 ml supernatant door afzuigen met een pipet zonder de 10 ml sediment. Om de hoeveelheid weefsel vezels in het monster te verminderen, voeg 30 ml leidingwater om het sediment en laat nog 10 min. Herhaal dit totdat de vloeistof helder. Verwijder supernatant en breng de 10 ml gewassen sediment naar een gerasterde petrischaal of tellen van larven. Spoel de cilinder met 10 ml leidingwater en vervolgens het water toe te voegen aan het monster. Opmerking: Als grote hoeveelheden vuil in het monster kan de identificatie van de Trichinellalarven (figuur 1) te voorkomen, moet verder wasstappen worden uitgevoerd, indien nodig. Microscopisch onderzoek Gebruik trichinoscoop of stereomicroscoop met een substap uitgezonden lichtbron van regelbare, in een 15 tot 20x vergroting de monsters onmiddellijk na de wasstappen onderzoeken. Na het storten van het monster in de gerasterde petrischaal, onderzoekt de schaal / bekken systematisch raster door raster. Als er geen verdachte structuren worden gevonden, beweeg de vloeistof in de gerasterde petrischaal of tellen van larven in een circulaire manier om eventuele Trichinella la toestaanrvae, die mogelijk zijn uitzicht, zich ophopen in het midden van de petrischaal. Herhaal het onderzoek. Als een verdachte structuur wordt gevonden, te verhogen vergroting tot 40 – 100X. Verwijderen Trichinellalarven uit de schaal / bekken met een pipet en in een buis met een 90% ethanol. Na het volledige gerecht is onderzocht, herhaalt u de procedure, vanaf de zachte schudden van de schotel / bekken. Herhaal de procedure ten minste drie maal of totdat er geen larven meer worden gevonden. Tel het aantal larven. Correleren met de hoeveelheid spierweefsel getest en aanwezig larven per gram (lpg). Als er te veel larven aanwezig zijn bij de vertering vloeistof naar de larvale aantal betrouwbaar te bepalen zijn, de terugkeer van de vloeistof met de larven van de maatcilinder, afspoelen met leidingwater uit een squeeze wassen fles, en laat larven naar de bodem. Na 10 minuten sedimentatie, verminder de supernatant om een bepaald volume (bijvoorbeeld10 mL). Om de exacte volume te bepalen, breng het supernatant naar een nieuwe cilinder met een pipet. Suspendeer larven homogeen in de vloeistof door krachtig schudden. Tijdens het schudden beweging, voeg 12 druppels van 20 ul larvale schorsing op een petrischaal. Onderzoek elke druppel met een microscoop. Bepaal het aantal larven in 240 pi en verwijder de hoogste en laagste telling. Extrapoleren aantal larven tot het totale volume (bijvoorbeeld 10 ml) supernatant. Opmerking: De kwaliteit van de stereo-microscoop is van het grootste belang voor de identificatie van Trichinellalarven. Wanneer de larven in een buis worden verzameld door een pipet, zorgvuldig te controleren dat de larven niet plakken op de pipet muur, maar worden overgebracht naar de buis. Opmerking: Positieve Trichinella bevindingen uit samengevoegde monsters moet terug van het zwembad worden herleid tot het karkas van herkomst. Hier moet de grootte van het zwembad geleidelijk worden verlaagd totdat de positieve karkas is identiteitceerd. De steekproefomvang kan worden verhoogd tijdens dit proces gevoeligheid te verhogen. Wanneer het onderzoek van een verzamelmonster een positieve of onzeker Hierdoor wordt een verdere 20 g monster van elk varken. De 20 g monsters van vijf varkens samengevoegd en onderzocht met behulp van de beschreven werkwijze. Aldus worden monsters van 20 groepen van vijf varkens onderzocht. Wanneer Trichinella in een samengevoegde monster wordt gedetecteerd van vijf varkens, zijn 20 g monsters van de afzonderlijke varkens in de groep en elk wordt afzonderlijk onderzocht totdat de positieve karkas van herkomst wordt gedetecteerd.