Ici, nous décrivons un procédé pour l'isolement de cellules dans le microenvironnement du pancréas embryonnaire à partir du tissu, du nouveau-né et de l'adulte souris, en se concentrant sur l'isolement des cellules mésenchymateuses. Cette méthode permet le profilage de l'expression génique des cellules et la sécrétion de protéines afin d'élucider les signaux extrinsèques qui régulent le développement du pancréas, de la fonction, et la tumorigenèse.
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
homéostasie énergétique et la digestion des aliments chez les mammifères dépendent de la fonction pancréatique appropriée. Le pancréas adulte se compose de deux grands compartiments cellulaires: le exocrines et le système endocrinien. Les cellules exocrines, y compris les cellules acineuses qui produisent et sécrètent des enzymes digestives et les cellules des canaux qui transportent ces enzymes de l'intestin, englobant plus de 80% de la masse totale du pancréas 1. Les cellules endocrines, qui comprennent des cellules bêta productrices d' insuline et de glucagon par les cellules alpha productrices sont organisées dans les îlots de Langerhans qui sont incorporés dans le tissu exocrine et sécrètent des hormones pour réguler les niveaux de glucose dans le sang 2.
Les cellules pancréatiques acquièrent leur sort différencié à travers un très réglementé, un processus en plusieurs étapes 3. Les preuves suggèrent que les signaux fournis par extrinsèques neuronale, endothelial et des cellules mésenchymateuses guident la différenciation des cellules du pancréas et de la prolifération en til embryon 3, 4, 5. Un exemple est l'exigence de l'aorte pour la spécification des précurseurs précoces du pancréas 6. Plus tard au cours du développement, les cellules endothéliales se sont révélés jouer un rôle central dans le développement des deux cellules endocrines et exocrines du pancréas et de favoriser la différenciation des cellules bêta 4, 6, 7. Les cellules mésenchymateuses se sont révélés favoriser la survie et le développement des progéniteurs du pancréas commun, principalement par la sécrétion de la Fgf10 du facteur de croissance 8, 9. Nous avons en outre montré que ces cellules soutiennent la prolifération des précurseurs endocrines et exocrines, ainsi que des cellules différenciées (y compris les cellules acineuses et bêta) dans le pancréas embryonnaire 5. Récemment, les cellules mésenchymateuses étaient encoremontré pour réguler la différenciation des cellules endocrines 10.
Chez l'adulte, la fonction des cellules bêta et de masse se sont révélées dépendre des cellules dans leur microenvironnement, y compris des neurones, immunitaire et des cellules endothéliales, péricytes, ainsi que 11, 12, 13. Pendant les blessures, les cellules endothéliales ont été montrés à recruter des cellules immunitaires au pancréas pour promouvoir la réplication des cellules bêta 13. Les cellules endothéliales ont encore été montrées pour produire la matrice extracellulaire (ECM) des composants pour soutenir l' expression de l' insuline et des cellules bêta fonction 14. Nous avons récemment démontré l'exigence de péricytes des îlots pour la fonction des cellules bêta 11. Enfin, les cellules du stroma du pancréas ont été montrées pour réguler la progression du pancréas adénocarcinome canalaire (ACPE) 15, 16. Cependant, l'identité de signaux extrinsèques qui guident le développement du pancréas, de la fonction, et la tumorigenèse sont en grande partie inconnus.
L'identification des signaux fournis par les cellules du micro-environnement du pancréas nécessite la caractérisation des gènes et des protéines exprimées par ces cellules. Cela dépend de l'isolement de ces cellules du pancréas afin d'effectuer l'expression des gènes et des analyses protéomiques et / ou à établir des lignées cellulaires. Ici, nous proposons une méthode pour isoler des cellules mésenchymateuses du microenvironnement du pancréas en utilisant le tissu digestion enzymatique et activé par fluorescence tri cellulaire (FACS) soit des cellules ou des cellules immunofluorescence marquées exprimant des protéines fluorescentes. Ce protocole a été réalisé avec succès pour isoler et analyser la protéine fluorescente jaune (YFP) exprimant des cellules mésenchymateuses du pancréas embryonnaire, néonatale et adulte 5, 17.
Ici, nous décrivons un procédé pour isoler et analyser des cellules du micro-environnement du pancréas. Cette méthode peut être utilisée pour isoler des cellules mésenchymateuses à partir du tissu pancréatique embryonnaire et adulte. En outre, nous avons utilisé avec succès ce protocole pour isoler les cellules endothéliales de l'adulte et du pancréas néonatal 5, 17. Cependant, il peut ne pas convenir pour l'obtention d'une suspension à cellule unique et reproductible des cellules épithéliales pancréatiques (protocoles alternatifs sont décrits dans les références 18, 23 et 24). En utilisant cette méthode, les cellules marquées par fluorescence, soit l'expression de protéines fluorescentes ou immunocolorées pour des marqueurs de surface, peuvent être purifiés par FACS ou analysées par cytométrie en flux. L'ARN peut être extrait de cellules purifiées pour profiler leur motif d'expression génique. Alternativement, les cellules purifiées peuvent être cultivées pour établir une lignée cellulaire pour l'analyse protéomique ultérieure. Cette méthode permettra à la caractérisation des facteurs expressed par le microenvironnement du pancréas, qui régissent son organogenèse, la physiologie et la physiopathologie.
Le mésenchyme pancréatique soutient organogenèse tissulaire en favorisant la prolifération des précurseurs et des cellules différenciées 5, 9. Ces cellules ont été présentés pour soutenir l'expansion des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) -derived progéniteurs pancréatiques 17, 25, 26. Par conséquent, la délimitation de l'identité des facteurs mésenchymateuses embryonnaires faciliterait les efforts actuels pour générer des cellules bêta productrices d'insuline à partir de cellules hES et les cellules pluripotentes induites souches (CISP) en tant que traitement potentiel du diabète. Des études génétiques de souris ont permis d'identifier des facteurs de croissance, tels que Fgf10, qui sont produites par le mesenchyme pour favoriser l'expansion de l'épithélium pancréatique pendant les premiers stades du développement du pancréas3, 9. Dans le but d'identifier les facteurs supplémentaires exprimés dans le mésenchyme embryonnaire, nous avons isolé ces cellules en utilisant microdissection laser capturé, extrait de leur ARN, et effectué une analyse d'expression génique 26. Cependant, en plus d'être travail intense, cette méthode repose sur l' identification de cellules en fonction de leurs caractéristiques morphologiques, ce qui limite son utilisation à des stades de développement avant la ramification de l'épithélium dans le mesenchyme environnant (c. -à- E12.5). Pour caractériser les cellules mésenchymateuses à des stades de développement plus tard, nous avons utilisé la méthode décrite ici 5, 17.
Nous avons utilisé cette méthode pour analyser l' expression des marqueurs de surface par mésenchyme pancréatique néonatale 5. En outre, les cellules mésenchymateuses sont isolées à partir du tissu pancréatique embryonnaire et néonatale de Nkx3.2 -Cre, les souris R26 EYFP, sur la baseleur marquage fluorescent dans cette lignée de souris, et ont été cultivées pour établir des lignées cellulaires 17. L'analyse protéomique de ces cellules ont permis l'identification des facteurs sécrétés par le mésenchyme pancréatique avec la capacité de promouvoir progéniteurs pancréatiques CSEh dérivées 17. En outre , nous avons utilisé cette méthode d'isolement des cellules pour purifier les cellules mésenchymateuses à partir de tissus pancréatiques adultes pour l' extraction d'ARN et l' expression génique analyse 17. Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour identifier des gènes et des protéines exprimées par le mesenchyme du pancréas, de la capacité à soutenir le développement des cellules du pancréas.
cellules mésenchymateuses pancréatiques ont ensuite été présentés à jouer un rôle dans le pancréas tumorigenèse. PDAC est caractérisée par la formation d'un stroma riche desmoplastique fibroblaste comprenant des fibroblastes, des cellules immunitaires et 27 l' ECM. Alors que le stroma a été pensé pour favoriser le développement d'un grand nombreles types de cancer, il a été montré pour empêcher la progression PDAC 15, 16, 28. Ceci suggère que les composants du stroma du pancréas sécrètent des facteurs qui inhibent la tumorigenèse. En outre, les changements dans la composition du stroma cellulaire ainsi que dans le phénotype cellulaire peuvent sous – tendre leurs effets sur les cellules epitheliales 15, 16, 28. La méthode décrite ici peut donc aider à caractériser les différents types de cellules qui composent un stroma PDAC par rapport au tissu du pancréas sain. Il serait en outre permettre la purification des différents types de cellules stromales pour caractériser les changements potentiels dans leurs profils d'expression génique durant la progression de la PDAC. Toutefois, en raison de changements dans la composition de l' ECM du pancréas pendant 27 tumorigenèse, les réglages des paramètres de digestion du tissu, telles que l'inclusion de suppional Types de collagénase ou de l'augmentation du temps d'incubation peuvent être nécessaires.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |