운동 조건의 혈청을 이용한 인대 구조의 치료 : Translational Tissue Engineering Model

다음 절차는 University of California, Davis의 Institutional Review Board에서 승인 한 프로토콜을 준수합니다. 조사를 시작하기 전에 지역 윤리위원회와상의하십시오. 1. 인간 ACL 잔여 물에서 일차 섬유 아세포 분리 참고 : 무균 상태를 유지하고 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)의 모든 단계를 수행하십시오. 아래 설명 된대로 적절한 윤리 검토위원회로부터 인간 조직의 수집 및 사용에 대한 승인을 얻습니다. 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 100x 항생제 / 항균제 용액을 희석하여 5x 항생제 / 항균제 (ABAM) 소화 단계 때까지 4 ML ° C 50 ML 원추형 튜브에 5X ABAM 솔루션에서 ACL 조직 조각을 수집합니다. 필요한 경우 1x1x1cm3의 최대 크기로 면도날로 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 주의 : 지역의 생물학적 위해 규정을 준수하십시오.생물학적 유해 물질의 적절한 사용 및 생물학적 유해 폐기물의 오염 제거 및 처리. 조직 조각을 잠수시키기 위해 충분한 양의 콜라게나 제 용액을 준비하십시오. 1x 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 20 % 태아 소 혈청 (FBS)과 0.22 μm의 필터를 포함하는 높은 포도당 Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)에 콜라게나 제 제 II 형 (1 MG / ML)을 용해. ACL 조직을 PBS로 3 회 헹굽니다. 조직을 분해하십시오. ACL 조직을 새로운 50 ML 원추형 튜브로 옮기고 조직을 잠수시키기 위해 충분한 양의 콜라게나 제 용액을 첨가합니다. 37 ° C에서 밤새 품는다 (~ 17 시간). 소화 기간이 완료되기 전에 10 % FBS와 100 U / mL 페니실린으로 DMEM 고 포도당 배지를 보충하여 성장 배지 (GM)를 준비하십시오. 소화 시간이 완료되기 15 분 전에, 5 분 간격으로 3 회 조직 함유 50 mL 튜브를 간단하게 와동시킨다. 25 ML 혈청 피펫을 사용하여 적극적으로 티를 깰 소화 조직을 씹다더 이상 세포를 떼어 놓는다. 5 분 동안 1,500 xg에서 원심 분리하십시오. 10 ML GM에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 대기음. 1.8-1.9 단계를 세 번 더 반복하십시오. 마지막 원심 분리 후, 5-10 mL GM에서 펠렛을 재현 탁하십시오. 세포 현탁액의 작은 샘플을 사용하여 hemocytometer로 세포 수를 계산하고 Trypan Blue를 사용하여 세포 생존 능력을 평가하십시오. 플레이트 당 3-4 X 10 5 세포의 밀도에서 15cm 조직 배양 플레이트에 세포 현탁액을 플레이트. 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 유지되는 멸균 배양기에서 70 %의 합류까지 배양하여 3 일마다 GM을 변화시킵니다. 5 구절 이내에 세포를 사용하거나 저장하십시오 (아래 참조). 나중에 사용할 수 있도록 세포를 고정하십시오. 다음과 같이 70 % 합류에서 세포를 Trypsinize. 매체를 대기음과 PBS로 세포를 씻으십시오. 조직 배양 플레이트의 바닥을 막기 위해 미리 데워진 (37 ℃) 0.05 % 트립신을 충분히 첨가하십시오. 배양 배양기에 플레이트를 놓습니다.세포가 분리 될 때까지 ~ 5 분 동안 ator (세포가 광학 현미경을 사용하여 떠 다니는 지 확인). 피펫을 사용하여 세포를 수집하고 팔콘 튜브에 분배하십시오. 원심 분리기로 세포를 펠레 트하고, 20 % FBS 및 10 % 디메틸 술폭 사이드 (DMSO)를 함유하는 DMEM 고 포도당 배지에서 세포를 재순환시켰다. cryovials에 나누어지는 세포 현탁액과 적어도 24 시간 -1 ° C / 분에서 시원한. 액체 질소로 냉동 냉동 보관하십시오. 2. 실리콘 코팅 플레이트 준비 35mm 조직 배양 플레이트를 준비하십시오 : 뚜껑을 제거하고 평평한 표면에 열린 플레이트를 배치하십시오. 제조 업체의 지침에 따라 실리콘 엘라스토머 키트를 혼합하십시오. 35mm 플레이트 당 약 2mL를 분배하기 위해 10mL 주사기를 사용하십시오. 실리콘이 2-3 일 동안 상온에서 경화되도록하십시오. 3. Brushite 시멘트 앵커 준비 원통형 실리콘을 함유 한 실리콘 역 성형 틀을 미리 준비하십시오.앵커 형성을위한 것입니다. 역 금형은 원하는 앵커 모양과 크기의 사양으로 만들 수 있습니다. 최종 앵커의 원하는 높이와 직경을 결정합니다. 이 프로토콜은 직경 약 3.25mm의 플라스틱 실린더가 놓여진 35mm 조직 배양 접시에서 공예 실리콘으로 형성된 맞춤형 금형을 사용하여 약 6.5mm의 최종 금형 높이를 허용합니다. 최종 앵커 치수는 높이가 약 3-3.5 mm이고 직경이 약 3.4 mm이고 앵커의 바닥에서 1.5 mm 핀이 돌출되어 있습니다. 금형을 만들 35mm 접시에 미 경화 실리콘을 추가하십시오. 플라스틱 실린더를 적절하게 배치하십시오. 참고 : 플라스틱 실린더의 크기에 따라 최종 앵커의 직경이 결정됩니다. 플라스틱 실린더의 위치와 사용 된 실리콘의 양은 다른 높이의 앵커를 만들기 위해 수정할 수 있습니다. 금형 내의 우물 바닥과 금형 자체의 바닥 사이의 두께는 d얼마나 많은 핀이 앵커 바닥에서 튀어 나와서 나중에 앵커가 실리콘 코팅 된 접시에 단단히 고정 될 수 있는지 결정하십시오. 실리콘을 경화시킨 후, 플라스틱 실린더를 제거하고 35mm 접시에서 금형을 제거하십시오. 3.5 M orthophosphoric / 100 mM 구연산 용액을 준비한다. 0.961 g의 구연산을 11.5 mL의 orthophosphoric acid에 녹인다. MilliQ 물로 용액의 부피를 최대 50 mL로 가져옵니다. 실온에서 용액을 저장하고 빛으로부터 보호하십시오. 금형을 준비하십시오 : 금형의 원통형 구멍의 중앙에 하나의 미세 관 핀을 놓으십시오. 얼음에 플라스틱 무게 보트에 1g / ML 농도에서 β – tricalcium 인산염과 orthophosphoric / 구연산 솔루션을 결합하십시오. 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 시멘트를 격렬하게 섞는다. 시멘트를 분쇄하여 혼합을 계속하고 피펫 혼합물을 몰드에 넣습니다. 채워진 곰팡이를 2,250 x g에서 1 분간 원심 분리하십시오. 브러시 사이트 시멘트 앵커를 상온에서 밤새 설정할 수 있습니다. 몰드에서 앵커를 제거하고 각 실리콘 코팅 플레이트에서 두 개의 앵커를 12 mm 간격으로 고정하십시오. 70 % 에탄올을 분무하여 고정 된 플레이트를 소독하고 플레이트와 뚜껑을 모두 채우고 BSC에 넣습니다. 최소 30 분이 경과 한 후, 플레이트를 대기음으로 뚜껑을 교체하고 필요할 때까지 BSC에 보관하십시오. 4. 인간 혈청 확보 해당 윤리 검토위원회의 승인이이 의정서에 대해 획득되었는지 확인하십시오. 혈청에서 원하는 변화를 일으킬 수있는 주어진 개입 ( 예 : 운동, 음식 또는 약물 중재)에 참여할 수 있도록 서면 동의를 얻었 음을 확인하십시오. 여기에서는 휴식 시간과 저항 운동 후 15 분 간의 수집에 대해 설명합니다. 훈련 된 phlebotomist를 사용하여 적절한 피난 용기에 venipuncture하여 참가자의 휴식 혈액 샘플을 얻으십시오. </li> 참가자가 원하는 운동 프로토콜에 참여하게 한 후 운동 후 혈액 샘플을 수집하십시오. 이전에 설명한대로 1 , 내생 생화학 반응을 자극하기 위해이 실험에서 저항 운동 프로토콜을 사용합니다. 참가자들에게 세트 사이에 1 분 휴식으로 5 세트의 레그 프레스를 수행하게합니다. 다음으로, 참가자들이 일련의 무릎 확장기와 햄스트링 컬 세트를 휴식없이 연속적으로 수행 한 다음 세트 사이에서 1 분 휴식으로 3 회 연속 연습을 반복하십시오. 혈액이 응고되기 전에 1,500 xg에서 10 분간 원심 분리하십시오. 무균 상태에서 미래의 배지 보충 (혈청 4 ℃에서 저장) 및 생화학 분석 (-20 ℃에서 저장된 혈청의 작은 분액)을 위해 멸균 튜브에 혈청을 옮깁니다. 5. 형태 조작 된 인대 참고 : 사전에 기본 fi 확장Broblasts 및 고정 된 brushite 앵커와 실리콘 코팅 플레이트를 준비합니다. 시약 준비 : 트롬빈을 준비하십시오. DMEM 고 포도당 배지에 200 U / mL의 소 트롬빈을 용해시킨다. 0.22 μm로 여과하고 분주하고 -20 ° C에 보관하십시오. 피브리노겐을 준비하십시오. DMEM 고 포도당 매체에 소의 피브리노겐을 20 mg / mL로 용해시킨다. 용해를 돕기 위해 30 분마다 소용돌이 치는 37 ° C 수조에서 3 ~ 4 시간 동안 품어 낸다. 0.22 μm에서 필터 (여러 개의 필터가 필요할 수 있음), 분액 및 -20 ° C에서 보관하십시오. aprotinin을 준비하십시오. aprotinin을 물에 10mg / mL로 용해시킨다. 0.22 μm로 여과하고 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오. 아미노 헥산 산을 준비하십시오. 물에 0.1g / mL의 아미노 헥산 산을 용해시킨다. 0.22 μm로 여과하고 분주하고 4 ° C에서 보관하십시오. 아스 코르 빈산을 준비하십시오. 50 mM 농도의 DMEM 고 포도당 배지에 아스코르브 산을 용해시킨다. 0.22 μm에서 여과하고 4 ° C에서 보관하십시오. <L- 프롤린을 준비하십시오. 50 MM의 농도에서 PBS에 L – 프롤린을 해산. 0.22 μm에서 여과하고 4 ° C에서 보관하십시오. 형질 전환 성장 인자 -β1 (TGF-β1)을 준비하십시오. 10 μg / ML의 농도에서 제조 업체의 지시에 따라 TGF – β1을 Reconstitute. 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오. 실험에 필요한 구성물의 수를 결정하고 충분한 수의 고정 플레이트가 준비되었는지 확인하십시오. 생물학적 복제와 기술적 복제가 모두 권장됩니다. 여기에서 강조한 연구 1 에서는 복제 된 기술 복제본과 12 개의 생물학적 복제물 (휴식 및 운동 후에 12 명의 혈청의 혈청)을 사용합니다. 참고 : BSC의 무균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오. 70 % 합류에 15cm 판에서 배양하여 세포를 확장합니다. 구조 당 2.5 x 10 5 세포가 필요합니다. 세포를 트립신 처리하고 GM에서 3.67 x 10의 농도로 resuspend5 세포 / mL. 필요한 구조의 수에 대한 마스터 믹스 생성 : 1 construct의 경우 마스터 믹스는 681 μL 세포 현탁액 (2.5 x 105 세포 포함), 29 μL 트롬빈, 2 μL aprotinin 및 2 μL 아미노 헥산 산을 함유합니다. 마스터 믹스를 잘 혼합 한 후, 브러시 라이트 시멘트 앵커 주위에 '그림 8'패턴으로 각 고정 플레이트에 714 μL를 더한다. 마스터 믹스가 앵커의 측면과 직접 접촉하는지 확인하십시오. 마스터 믹스를 플레이트 전체에 골고루 분산 시키려면 각 플레이트를 살짝 두 드리십시오. 한 번에 하나의 플레이트에 대해 신속하게 하나의 플레이트 위에 균일하게 방울 모양으로 286 μL의 피브리노겐을 첨가하고 즉시 플레이트를 앞뒤로 그리고 BSC의 표면을 가로 질러 슬라이드시켜 피브리노겐을 분산시켜 세포 임베디드 피브린 겔을 형성하십시오 . 다음 판으로 진행하십시오. 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 유지 관리되는 멸균 배양기에 구조물을 넣은 다음 배양하십시오피브리노겐의 중합을 가능하게하는 적어도 15 분 동안. 구조 당 2 mL의 충분한 사료 배지 (FM)를 준비하십시오. GM에 200 μM 아스코르브 산, 50 μM 프롤린 및 5 ng / mL TGF-β1을 보충하십시오. 각 구조물을 덮기 위해 2 mL의 FM을 첨가하십시오. 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 총 14 일 동안 또는 원하는 종료점까지 유지 된 멸균 배양기에서 구조물을 배양하고 매 2 일마다 2 mL의 FM으로 배지를 상쾌하게합니다 6. 인장 시험용 인장 참고 : 인장 시험은 PBS 조에서 맞춤형 인장 시험기를 사용하여 수행되었습니다. 힘 트랜스 듀서에 결합 된 리버스 몰딩 된 그립은 시험 중 제 위치에서 브러시 라이트 시멘트 앵커를 고정시킵니다. 디지털 캘리퍼스를 사용하여 인대 구조물의 길이와 너비를 결정합니다. 조직의 단면적을 계산하십시오. 판에서 인대 구조물을 고정 해제하고 앵커를역 성형 그립을 사용하여 구조물을 PBS에 담근다. 그립 사이의 거리를 조절하여 구조의 길이를 초기 길이로 설정합니다. 시험을 시작합니다 : 0.4 mm / s (또는 ~ 3 % / s)의 변형률 속도로 구조물을 파손에 대해 변형시킵니다. 검사가 끝나면 조직 잔여 물을 콜라겐 함량에 맞게 처리하십시오 (7 절 참조). 결과로드 변형 데이터로부터 응력 – 변형률 데이터를 계산하고 관심있는 기계적 특성을 정량화하십시오. 예를 들어, 최대 인장 하중, 최대 인장 강도 및 탄성 계수 ( 즉 , 응력 – 변형률 곡선의 선형 영역에 대한 탄성 특성). 7. 조작 된 인대의 콜라겐 함량 정량 브러시 라이트 시멘트 앵커에서 인조 된 인대를 제거하고 120 ° C에서 25 분 동안 건조하십시오. 구조물의 건조 질량을 결정하고 개별 1.5 mL 튜브에 넣으십시오. 건식 구조물은 실온에서 보관 될 수있다.추가 처리까지. 각각의 구조에 200 μL 6 M HCl을 첨가한다. 흄 후드에서 2 시간 동안 가열 블록에서 120 ° C로 끓이십시오. 주의 : HCl은 부식성이 높고 산성이기 때문에 끓임 방지 / 안전 잠금 튜브 또는 기타 튜브 고정 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 튜브를 간단히 원심 분리하여 액체를 모으고 뚜껑 후드에서 1.5 시간 동안 가열 블록에서 120 ° C로 증발하도록 캡을 씌운다. 200 μL hydroxyproline 버퍼에 결과 펠렛을 Resuspend. 필요할 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오. 히드 록시 프롤린 완충액을 준비하십시오. 300 mL의 물에 16.6 g의 시트르산, 4 mL의 아세트산, 11.4 g의 NaOH를 넣고 용해 될 때까지 저어 준다. pH를 6-6.5로 맞추고 부피를 500 mL로 가져온다. 보존제로 250 μL의 톨루엔을 첨가하고 4 ° C에서 보관하십시오. 시약 준비. 트랜스 -4- 하이드 록시 -L- 프롤린을 준비하십시오. 물에 녹여 4 mg / mL 용액을 만든다. <> chloramine-T를 준비하십시오. 물에 녹여 14.1 mg / mL 용액을 만든다. 알데히드 – 과염소산 염을 준비하십시오. 1.5 g 4- 디메틸 아미노 벤즈알데히드를 6 mL 1- 프로판올, 2.6 mL 과염소산 (주의 : 부식성, 강한 산화제, 적절한 예방 조치를 취함) 및 0.5 mL의 물에 녹인다. 새로운 1.5 mL 튜브 세트에서 히드 록시 프롤린 완충액에 각각의 resuspended pellet 샘플을 200 μL 부피로 희석하십시오. 참고 : 희석은 시료의 예상 콜라겐 함량에 따라 1 : 4 ~ 1 : 50의 시료 : 완충액 범위 일 수 있습니다. 따라서 주어진 샘플 세트에 적합한 희석 인자를 결정하기 위해 (즉, 표준 곡선의 중간에 샘플을 놓는) 시행 착오 테스트가 필요할 수 있습니다. 히드 록시 프롤린 표준을 준비하십시오. 히드 록시 프롤린 완충액 (7.5.1 절 참조)에서 80 μg / mL로 희석하십시오. 0-20 μg / mL 사이에서 6-8 200 μL 표준을 만들기 위해 연속 희석을 수행하십시오. 150 μL 14.1 mg /mL 표준 용액과 희석 된 시료 각각에 Chloramine T 용액을 넣으십시오. 소용돌이 칠하고 실온에서 20 분 동안 인큐베이션한다. 각 시료와 희석 된 시료에 150 μL 알데히드 – 과염소산 염 용액을 첨가한다. 와동과 가열 블록에서 60 ° C에서 15 분 동안 품다. 과도한 알데히드 – 과염소산 염 용액은 현지 규정 (과염소산 포함)에 따라 유해 폐기물로 폐기하십시오. 표준 및 샘플을 식히기 전에 각각 200 μL를 96- 웰 플레이트로 나누어 분주하십시오. 분광 광도계에서 550 nm에서 플레이트를 읽습니다. 현지 규정 (과염소산 포함)에 따라 판과 나머지 부피를 위험 폐기물로 1.5 mL 튜브에 폐기하십시오. 총 콜라겐 및 콜라겐 분획의 계산. 히드 록시 프롤린 표준 곡선을 사용하여 각 시료의 흡광도 값을 히드 록시 프롤린의 마이크로 그램으로 변환하십시오. 각 웰에 2.5를 곱하여 히드 록시 프롤린의 양을 계산하십시오.희석 된 샘플. 500 μL 총 혼합물 중 200 개 (200 μL 희석 시료 + 150 μL chloramine T + 150 μL AP 용액)만이 각 시료 웰에 첨가되었음을 상기하십시오. 희석 배수 (7.7 절)를 곱하여 원래 표본의 히드 록시 프롤린 양을 계산합니다. 콜라겐의 양을 계산하기 위해 0.137로 나누십시오 (콜라겐이 13.7 %의 하이드 록시 프롤린 20을 함유한다고 가정 함). 참고 : 콜라겐에서 포유류의 하이드 록시 프롤린은 조직과 포유류 종에 따라 약간 다릅니다. 예를 들어, 돼지와 양 아킬레스 건은 각각 13.5와 13.7 % (하이드 록시 프롤린 질량 / 건조 조직 질량)를 포함합니다 21 . 여기에서 13.7 %를 사용하여 콜라겐의 히드 록시 프롤린 (hydroxyproline)의 비율을 측정합니다.이 값은 다음 식을 사용하여 조직 샘플의 콜라겐 함량을 계산하는 데 사용됩니다. 건조 질량으로 나누어 콜라겐 함량을 계산하십시오비율로 변환하십시오. 8. 분자 종말점의 정량화 참고 : 인장 시험 및 콜라겐 함량의 주요 결과 외에도 2D 또는 3D 조직에서 분자 종말점을 측정하여 역학적 통찰력을 추가 할 수 있습니다. Bioassays는 분자 종말점을 결정하는데 사용될 수 있습니다 ( in vitro 인대 기능에 대한 운동 후 혈청 환경의 영향에 대한 아래의 절 참조). 3D 조직의 경우 : 위의 5 단계에 따라 구조물을 준비하십시오. 치료 / 개입을 만든 후에, 액체 질소에서 구조물을 스냅 프리즈 (quick-freeze)한다. 드라이 아이스로 식힌 박격포와 유봉을 사용하여 파우더로 분쇄합니다. 8.4 / 5 단계 계속). 2D 조직의 경우 : 문화 인간 ACL 섬유 아세포는 월에 합류DMEM이 포함 된 6- 웰 플레이트에서 배양 하였다. DMEM을 대기음으로하고 실험 전략 ( 예 : 시간 경과 또는 용량 반응 실험)에 따라 치료 매체를 적용하십시오. 치료 매체를 대기음과 PBS로 세포를 씻으십시오. 적절한 추출 버퍼 / 시약을 사용하여 수집 할 세포를 긁으십시오 (다음 참조). 단백질 발현 분석 : 단백질 용 해물을 얻기 위해 시토 졸 추출 버퍼 ( 예 : 250 mM sucrose, 50 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgCl2 및 protease / phosphatase inhibitor cocktail)를 사용하십시오. 단백질 농도 분석을 수행하고 표준 서양 얼룩 절차에 따라 분석을 계속하십시오. 유전자 발현 분석 : 고품질 RNA를 얻기 위해 제조업체의 지침에 따라 500 μL RNA 분리 시약을 사용하여 총 RNA를 분리합니다. 표준 절차에 따라 역전사 및 실시간 정량 PCR 분석을 수행하십시오. DNA 단리 : g을 분리하고 정량화하십시오.DNA 추출 시약을 사용하여 제조자의 지침에 따라 enomic DNA를 추출한다. 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 시료 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 정량하십시오.