علاج الرباط ينشأ مع مصل مكيفة مكيفة: نموذج هندسة الأنسجة الانتقالية
Summary
نقدم نموذجا من أنسجة الرباط التي يتم التعامل مع البنى ثلاثية الأبعاد مع مصل الدم مكيفة ممارسة الإنسان وتحليلها لمحتوى الكولاجين، وظيفة، والكيمياء الحيوية الخلوية.
Abstract
التجارب في المختبر ضرورية لفهم الآليات البيولوجية. ومع ذلك، فإن الفجوة بين زراعة الأنسجة أحادية الطبقة وعلم وظائف الأعضاء البشرية كبيرة، وترجمة النتائج غالبا ما تكون سيئة. وبالتالي، هناك فرصة كبيرة لنهج تجريبية بديلة. هنا نقدم نهجا فيه الخلايا البشرية معزولة عن الإنسان الأمامي الصليبي الأنسجة الرباط المخلفات، توسعت في الثقافة، وتستخدم لتشكيل الأربطة هندستها. ممارسة يغير البيئة البيوكيميائية في الدم بحيث يتم تحسين وظيفة العديد من الأنسجة والأعضاء والعمليات الجسدية. في هذه التجربة، بناء الرباط استكملت وسائل الإعلام الثقافة مع المصل البشري التجريبية التي كانت "مشروطة" من خلال ممارسة الرياضة. وبالتالي فإن التدخل هو أكثر أهمية بيولوجيا منذ يتعرض الأنسجة التجريبية إلى البيوكيميائية الذاتية الذاتية كامل، بما في ذلك البروتينات ملزمة والمركبات التي يمكن أن تتغير جنبا إلى جنب مع نشاطوكيل غير معروف من الفائدة. بعد العلاج، والأربطة هندستها يمكن تحليلها لوظيفة ميكانيكية، ومحتوى الكولاجين، مورفولوجيا، والكيمياء الحيوية الخلوية. وعموما، هناك أربع مزايا رئيسية مقابل الثقافة أحادية الطبقة التقليدية والنماذج الحيوانية، من النموذج الفسيولوجي للأنسجة الرباط الذي يتم عرضه هنا. أولا، يبني الرباط ثلاثي الأبعاد، مما يسمح للخصائص الميكانيكية ( أي وظيفة) مثل الإجهاد الشد النهائي، تحميل الشد القصوى، ومعامل، ليكون كميا. ثانيا، يمكن فحص التداخل، واجهة بين بوني والعناصر سينو بالتفصيل وفي سياق وظيفي. ثالثا، إعداد وسائل الإعلام مع المصل بعد ممارسة يسمح للآثار الناجمة عن البيوكيميائية التي يسببها النشاط، والتي هي المسؤولة عن مجموعة واسعة من الفوائد الصحية من التمارين الرياضية، ليتم التحقيق فيها بطريقة غير منحازة. وأخيرا، فإن هذا النموذج التجريبي يعزز البحث العلمي بطريقة إنسانية وأخلاقية من خلال استبدال استخداموالولاية الأساسية للمعاهد الوطنية للصحة، ومركز مكافحة الأمراض، وإدارة الغذاء والدواء.
Introduction
إصابات الأوتار والرباط شائعة ويمكن أن يكون لها عواقب وخيمة على التنقل الطبيعي ونوعية الحياة. التدخل الجراحي غالبا ما يكون ضروريا ولكن يمكن أن يكون النجاح محدود ومتنوع 4 ، 5 . الفهم الحالي لكيفية تطور الأوتار والأربطة، وتنضج، والاستجابة للإصابة غير مكتملة، وبالتالي هناك حاجة إلى نماذج بحث فعالة لتوفير نظرة ثاقبة على تطوير العلاجات أكثر فعالية 5 . لمعالجة هذه الفجوة المعرفية، يمكن استخدام النماذج الحيوانية ولكن في الدراسات المجراة هي معقدة بطبيعتها مع صعوبة في السيطرة على البيئة واستهداف التدخلات مباشرة إلى الأنسجة المقصودة. في المقابل، يمكن بسهولة السيطرة على البيئة التجريبية ورصدها في المختبر مع ثقافة الخلية أحادي الطبقة التقليدية. ومع ذلك، فإن هذه التقنية قد تبالغ في تبسيط البيئة الكيميائية والميكانيكية، وبالتالي قد لا ريكابيتوفي وقت متأخر من السلوك في الجسم الحي من الخلايا. هندسة الأنسجة قادرة على الزواج من مزايا المجمع في بيئة الجسم الحي في النماذج الحيوانية مع السيطرة على البيئة في المختبر ويوفر أداة إضافية لدراسة علم وظائف الأعضاء. وبالإضافة إلى ذلك، المسلحة مع فهم أفضل للتنمية الرباط، قد هندسة الأنسجة أيضا توفير مصدر من الأنسجة الكسب غير المشروع عندما يتطلب إعادة الإعمار الجراحي 6 . وهكذا، فإن الطريقة الموصوفة هنا يصادق على الأنسجة في المختبر 3D المهندسة التي يمكن استخدامها لدراسة وظيفة الرباط والمورفولوجيا.
وقد تم استخدام وتر ترتكز على الفيبرين أو أرباب الرباط كنموذج في المختبر لدراسة العمليات الفسيولوجية بما في ذلك الكولاجين فيبريلوجينيسيس 7 وتطوير وتر 8 ، فضلا عن التطبيقات متعدية التي تم تقييمها فائدة مثل الأنسجة الكسب غير المشروع في نموذج الأغنام من كروي الأماميالأربطة سييت (أكل) إعادة الإعمار 9 . وقد أنشأت مختبرنا سابقا نموذج الرباط هندسيا 3D تمتد اثنين من براشيت، وهي مادة فوسفات الكالسيوم العظام بديلا، والمراسي الأسمنت. هذا النموذج يمكن أن تخضع لظروف تجريبية مختلفة بكل سهولة ببساطة عن طريق تكملة وسائل الإعلام والثقافة مع العوامل البيولوجية 10 أو تطبيق التحفيز الميكانيكي 11 . الأهم من ذلك، هذا النموذج العظام إلى العظام العظام يسمح للتحليل المتعمق للتخدير، واجهة بين بوني والعناصر سينو، التي هي عرضة للإصابة.
في الدراسة سلط الضوء على 1 هنا لتقديم هذه المنهجية، كنا مهتمين في تأثير التغيرات التي يسببها التمارين في الوسط البيوكيميائي على وظيفة الرباط. ممارسة يحسن الخلوية وظيفة الجهاز في مجموعة متنوعة من الأنسجة في جميع أنحاء الجسم 2 ، 3 ، </sup> 12 ، وهو تأثير يمكن أن يعزى إلى الإفراج عن مختلف المعروفة (على سبيل المثال، إيل-6 13 ، إيل-15 14 ، ميتورين مثل 15 ، إكسوسوميس 16 ، 17 )، وغيرها من العوامل البيوكيميائية غير معروفة صدر في الدورة الدموية النظامية . وعلاوة على ذلك، يتم إثراء البيئة البيوكيميائية بعد ممارسة مع الهرمونات استجابة للتمرين، والإفراج عن هو الذي يحفز من قبل تحفيز الجهاز العصبي متعاطفة من الغدد الإفرازية (على سبيل المثال ، الكورتيزول والكاتيكولامينات من الغدة الكظرية 18 ، وهرمون النمو من الغدة النخامية الأمامية 19 ). ومع ذلك، ط ن فيفو ، فإنه من المستحيل التفريق بين آثار التحفيز الميكانيكي لممارسة التمارين الرياضية من التمارين الرياضية التي يسببها التغيرات البيوكيميائية. في حين اتسمت بعض الدراسات الارتفاع المتوقع لبعض الهرمونات والسيتوكينات المتداولة استجابة لممارسةe كما ذكر أعلاه، هناك عوامل كثيرة جدا، معروفة وغير معروفة، لتلخص بأمانة في المختبر. وهذا يعني أن عزل عدد قليل من العوامل لدراسة في المختبر يعالج بشكل غير كاف تعقيد الاستجابة البيوكيميائية. في هذه الدراسة، قمنا بالتحقيق في كيفية التغيرات في بيئة البيوكيميائية في الدم، التي دفعتها ممارسة، يؤثر على وظيفة الرباط هندسيا. لعزل آثار التغيرات البيوكيميائية، حصلنا على المصل من المشاركين في البشر قبل وبعد نوبة من ممارسة المقاومة واستخدامها علاج الأربطة هندسيا 3D شكلت باستخدام الإنسان الرباط الصليبي الأمامي (أكل) الخلايا الليفية. باستخدام هذا النموذج، يمكننا الحصول على بيانات وظيفية، بما في ذلك الآثار على الخواص الميكانيكية ومحتوى الكولاجين، فضلا عن تحديد الآثار على الإشارات الجزيئية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف المخطوطة الحالية نموذجا من نسيج الرباط الذي هو منصة تجريبية مفيدة للمحققين مع مجموعة واسعة من المواضيع البحثية، من تطوير الأنسجة إلى متعدية / الأسئلة السريرية. ويستند نموذج الرباط هندسيا وصفها هنا على بروتوكول تنوعا التي يمكن تكييفها في نقاط مختلفة في جميع أنحاء سير العمل ( الشكل 1 وقسم المناقشة ). وعلاوة على ذلك، الطبيعة التقصيرية بطبيعتها للبيئة في المختبر يمكن أن تقترب من المجال الفسيولوجي عن طريق استكمال وسائل الإعلام تغذية مع مصل بشر الإنسان أو الحيوان مكيفة.
يمكن تشكيلها باستخدام الخلايا الليفية من مجموعة متنوعة من المصادر
في حين أن المنهجية والنتائج التمثيلية المعروضة هنا تستند إلى استخدام الخلايا الليفية أكل الأولية، ويمكن تعديل بروتوكول عزل الخلية لجمع أنواع أخرى من الخلايا الليفية الأولية. كما وصفتفي الشكل 4 ، والأربطة هندسية شكلت مع الخلايا الأولية معزولة من المانحين الإنسان الشباب تظهر انخفاض تباين المانحين. الخلايا الأولية محدودة بسبب العزل الأولي وتقييد مرور. واستخدام خطوط الخلايا قد يحسن استنساخ التجارب. استخدام أنواع الخلايا الأخرى قد تتطلب تعديلات في وسائل الإعلام ثقافة الخلية وصياغة هلام الليفين. على سبيل المثال، لاحظنا أن الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (مسس) ليست قادرة على تشكيل الأنسجة الخطية بين المراسي الأسمنت بروشيت على مدى 2 أسابيع في حين الخيول متفوقة الخلايا الليفية الرقمية المرن وتر، خلايا الفخذ نخاع العظم الفصلي، فرخ الخلايا الليفية الأوتار الجنينية ، والفئران C3H10T1 / 2 مسس بسرعة العقد وهضم هلام الليفين لتشكيل الأنسجة الخطية (ملاحظات غير منشورة). هذا التباين قد يكون نتيجة الاختلافات في انقباض الخلية، وانتشار، وإنتاج انزيم الفيبرين.
تطبيق الكيميائيةوالتحفيز الميكانيكي
في الطريقة الموصوفة هنا، الأنسجة القائمة على الفيبرين أشكال حول مرساة الاسمنت براشيت، مما يسمح لتطبيق التحفيز الميكانيكي عن طريق المفاعل الحيوي تمتد 11 ، وكذلك لاختبار الشد نقطة النهاية. وجود بروشيت الأسمنت لينة واجهة الأنسجة (التخدير) كما يقدم فرصة لمزيد من التحقيق والتحسين 22 ، 26 (انظر قسم التطبيقات السريرية أدناه). في هذه البيئة في المختبر ، مساهمة العوامل الكيميائية والميكانيكية يمكن تحديدها بسهولة أكبر؛ مثال على ذلك هو مبين في الشكل 5 ، حيث تم فصل تأثير بيئة ما بعد ممارسة المصل من المحفزات الميكانيكية من التمارين الرياضية. قد تكون هناك حاجة إلى دراسات رائدة لتحديد الإطار الزمني للتدخلات التجريبية، وتكوين العلاجات، ونقاط النهاية المناسبة للتوقع حدوث تغيير ملحوظ. فوعلى سبيل المثال، في دراسة ما بعد التمرين في مصل الدم 1 ، كان طول العلاج التجريبي مقيدا بتوريد المصل المستخدم لتكملة الوسائط، التي تم تغذية البنايات كل يوم ثان. وعلاوة على ذلك، خلال الأسبوع الثاني من الثقافة، واستكملت وسائل الإعلام الثقافة مع بقية أو مصل بعد ممارسة مع حمض الاسكوربيك و L- البرولين حافظت بينما تم إزالة تغف-β1. تغف-β1 هو عامل نمو الموالية للتليف المعروف الذي يزيد في المصل بعد ممارسة 27 . لذلك، لتجنب تحجب آثار تغف-β1 ذات الصلة من مصل ما بعد ممارسة، لم يتم الحفاظ على هذا السيتوكين في وسائل الإعلام والثقافة.
هذا النموذج هندسيا الرباط يمكن أيضا أن تستخدم لاختبار تأثير تمتد الميكانيكية. عن طريق الهندسة عكسها السيطرة على غرار لعقد نهايات مرساة الاسمنت بروشيت (على غرار اختبار الشد أحادي المحور هو مبين في الشكل 1 )، ويمكن تصميم المفاعلات الحيوية تمتد لاستيعاب المهندس الأربطة. وقد استخدم مختبرنا سابقا هذا النموذج للتحقيق في استجابة الإشارات الجزيئية للأربطة هندسية إلى الشد أحادية المحور تمتد في المفاعل الحيوي 11 حسب الطلب التي من شأنها أن توفر فهم أفضل للتصميم العقلاني للنموذج تمتد في المختبر أو حتى، من المحتمل، في الجسم الحي تمتد / النشاط / التطبيقات العلاجية.
تقييم الأربطة المهندسة
كما هو الحال مع الثقافة أحادي الطبقة التقليدية، يمكن أن يبنى 3D يبني لتعبير الجينات / البروتين. بالإضافة إلى ذلك، توفر التشكل 3D أيضا فرصة لتقييم التغيرات الوظيفية والصرفية والبنيات يمكن الحفاظ عليها في الثقافة لدراسات طويلة الأجل ( الشكل 3 ). في حين أن الأربطة المهندسة لا تعادل الأربطة الأصلية، الناضجة، فإنها تحمل التشابه مع الأوتار النامية / الأربطة وتتصرف على نحو مماثل للأنسجة الأصلية في استجابة للمواد المغذية"> 26، عوامل النمو 10 والهرمونات 25 ، وممارسة 11 ، 28. وبالتالي، في حين أن هناك ما يبرر الحذر قبل إجراء تعميمات واسعة من أي نموذج في المختبر ، والنتائج من اختبار بناء الرباط قد تكشف أو إبلاغ آلية فسيولوجية معينة قد تكون خلاف ذلك من المستحيل التحقيق في الجسم الحي.
إضافة وسائل الإعلام تغذية مع المصل مكيفة لنموذج مرنة وديناميكية مع تطبيقات واسعة
إن الميتابولوم البشري في الدم هو وسط 4،500 مركبة، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، البروتينات السكرية، البروتينات الدهنية، مشتقات الدهون، ركائز الطاقة، الأيض، الفيتامينات، الإنزيمات، الهرمونات، الناقلات العصبية، وعدد كبير من اللبنات / الوسيطة. 29 مزيد من التفتيش على ميتابولوم المصل البشري وفقا لفئات مجمع 29 يكشف أديتيفوائد أونال من دمج المصل التجريبي في التجارب في المختبر. وهذا هو، فإن غالبية المركبات ~ 4500 في المصل هي مسعور أو الدهون المستمدة، مما يؤكد على أهمية بروتينات ملزمة للنقل / الانحلال. ويترتب على ذلك أن التجميع تجريبيا ديناميات النقل المركب الداخلي، وبالتالي التوافر البيولوجي والتفاعلات المركب الهدف، سيكون من المستحيل تقريبا. وبالتالي، المصل التجريبي هو فعال بشكل خاص لدراسة المركبات التي من المعروف أن تعتمد على جزيئات التبعي للذوبان والنقل، وملزم الهدف، وآلية العمل.
مختبرنا لديه مصلحة طويلة الأمد في الفوائد الصحية من ممارسة الرياضة. التمرين يحسن وظيفة الخلوية والأعضاء في مجموعة متنوعة من الأنسجة في جميع أنحاء الجسم 12 ، وهو تأثير يمكن أن يعزى إلى مجموعة متنوعة من العوامل (على سبيل المثال، إيل-6 13 ، إيل-15 14 ، ميتورين مثل 15 ،إكسوسوميس 16 ، 17 ) التي يتم إطلاقها في الدورة الدموية النظامية. وتعكس البيئة البيوكيميائية بعد التمرين العوامل التي تم إصدارها سواء من التعاقد مع الهرمونات المستجيبة للتمرين العضلي والعوامل التي يتم إصدارها نتيجة لتحفيز الجهاز العصبي الودي للغدد الإفرازية (على سبيل المثال ، الكورتيزول والكاتيكولامينات من الغدة الكظرية 18 ، والنمو هرمون من الغدة النخامية الأمامية 19 ). استخدمنا مؤخرا نموذجا لمصل ما قبل وبعد ممارسة التحقيق في آثار البيوكيميائية الناجم عن ممارسة النشاط على الأنسجة المهندسة. 1 وفي حين لا تزال هناك العديد من المسائل المهمة المتعلقة بالبحث، إلا أن النموذج ليس محدودا بهذه الطريقة. على سبيل المثال، يمكن الحصول على المصل، سواء من مصادر حيوانية أو بشرية، بعد التدخلات الغذائية أو الدوائية، أو من مختلف الفئات العمرية أو السكان السريريةs 30 . وبهذه الطريقة، فإن المركبات الخارجية أو الذاتية ذات الاهتمام ستكون موجودة في وسائل الإعلام المصل والعلاج، بكميات بيولوجية، وسوف تتفاعل مع الأنسجة المستهدفة بالتنسيق مع البيئة الذاتية ( أي ، في سياق أكثر الفسيولوجية). هذا النهج دينامي نظرا لأنه من المرجح جدا أن تدخل معين سوف تمارس تأثير متعدد الأعضاء (ومتعدد المركب)، وبالتالي سيتم تعديلها في بيئة فسيولوجية. في حين أن هذا النهج يعرض بعض التحديات، حيث يتم تغيير العديد من المتغيرات البيوكيميائية النظامية في وقت واحد، بل هو النهج الذي قد يساعد على التغلب على عيوب المنهجية التجريبية التخفيضية بحتة 31 ، 32 . مجتمعة، وتنفيذ المصل مكيفة جنبا إلى جنب مع الأنسجة المهندسة ( في المختبر بيوميمتيك ) الأنسجة يمكن أن تستخدم كأداة لعلم وظائف الأعضاء والتغذية والبحوث السريرية الأسئلة.
<stronز> التطبيقات السريرية عديدة
نموذج هندسة الأنسجة المقدمة هنا يمكن استخدامها للتحقيق في الأسئلة البحثية التشريحية والسريرية التي النماذج التقليدية في المختبر لا يمكن. الرباط أو الوتر في الجسم الحي يحتوي على لينة إلى الصعب الانتقال منطقة الأنسجة يسمى التصلب. التخدير، الذي هو عرضة للإصابة الإجهاد الميكانيكية ذات الصلة 33 ، ويمكن دراستها في المقطع العرضي عن طريق تقنيات المجهر الهيستوكيميائية والإلكترون 22 ، 26 . هذه واجهة فريدة من نوعها هي ذات أهمية مضاعفة بالنسبة لأولئك الذين يعانون من انخفاض أو تقييد التنقل منذ الخمول البدني يضعف قدرة النسيج الضام لنقل الحمل إلى مناطق منخفضة إلى عالية الامتثال 34 ، مما أدى في نهاية المطاف إلى انخفاض عام في الامتثال الأنسجة وزيادة خطر الاصابة.
وقد استخدم مختبرنا مؤخرا هذا النموذج هندسة الأنسجة 25 </ سوب> لنموذج آخر للسكان، الرياضيين الإناث، الذين هم في خطر للإصابات النسيج الضام: الإصابة إصابة أكل ما يقرب من خمسة أضعاف من نظرائهم الذكور 35 . تم التحقيق في الآليات المحتملة التي يقوم عليها هذا التفاوت القائم على الجنس في الإصابة عن طريق معالجة بنايات الرباط مع تركيزات الفسيولوجية للهرمون الجنس للإناث، هرمون الاستروجين، في تركيزات التي تحاكي مراحل دورة الطمث. ومن المثير للاهتمام، تركيزات عالية من هرمون الاستروجين تثبيط التعبير الجيني والنشاط من أوكسيديز ليسل، والانزيم الأساسي المسؤول عن إنشاء ليسين يسين الروابط عبر في مصفوفة الكولاجين من الأربطة والأوتار. الأهم من ذلك، 48 ساعة من هرمون الاستروجين عالية (لمحاكاة المرحلة الجريبي) انخفض الرباط بناء صلابة دون تغيير كثافة الكولاجين من يبني. من وجهة النظر الفسيولوجية، وهذا يشير إلى أن الزيادات في التراخي الرباط في الإناث قد يكون راجعا، على الأقل جزئيا، إلى انخفاضعبر الارتباط تشكيل. من وجهة نظر تجريبية، هذه النتائج 25 تسليط الضوء على فائدة نموذج بناء 3D، مما يسمح النشاط عبر ربط وظيفية لفحصها. من وجهة نظر سريرية، ويمكن الآن أن تستخدم هذا النموذج لتظهر بسرعة للتدخلات التي يمكن أن تمنع الآثار السلبية لهرمون الاستروجين من وظيفة الرباط.
ملاحظات ختامية
هنا قدمنا منهجية مفصلة لتشكيل الأربطة هندسيا وفائدتها باعتبارها 3D في نموذج الأنسجة المختبرية. هذا النموذج قابل للتكيف إلى حد كبير مع مجموعة واسعة من الأهداف، وتوفير المرونة في نوع الخلية، والتدخلات، وقياس نتائج الفائدة. تكمل وسائل الإعلام تغذية مع مصل مكيفة يضيف السياق الفسيولوجية التي لا يمكن أن يتحقق في البيئة التقليدية في المختبر ، وتحسين النمذجة في علم وظائف الأعضاء الجسم الحي . وباختصار، نعتقد أن هذا هو وضع قابل للتطبيق على نطاق واسعلتر مع آثار مثيرة لتعزيز كل من مجالات علم وظائف الأعضاء وهندسة الأنسجة.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه نسيرك (دودو)، والمنح الدراسية جمعية الهلال الأحمر الأفغاني (آل)، و أوك ديفيس كلية العلوم البيولوجية منحة (كب).
Materials
| Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 | Entomoravia | N/A | For brushite cement anchors; include info on multiple sources and alternative products |
| β-tricalcium phosphate | Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) | N/A | For brushite cement anchors; include whether it's hazardous /toxic |
| o-phosphoric acid, 85% (w/w) | EMD Millipore | PX0995 | For brushite cement anchors; include info on preparation |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500g | For brushite cement anchors |
| Falcon 35mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | For silicone-coated plates |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | For silicone-coated plates |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | SH3002802 | For cell isolation and expansion |
| 100X antibiotic/antimycotic solution | VWR | 45000-616 | For cell isolation |
| Type II collagenase | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | For cell isolation |
| 100X penicillin/streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For cell isolation |
| Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated | EMD Millipore | SCGP00525 | For reagent sterilization |
| DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine | VWR | 10-013-CV | For cell and tissue culture |
| Fetal bovine serum | BioSera | FBS2000 | Component of tissue digestion media and growth media |
| Penicillin G Potassium Salt | MP Biomedicals | 0219453680 – 100 MU | Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C. |
| CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 x 20 mm) | VWR | 82050-598 | For cell culture |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | For cell isolation |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | For cell freezing media |
| Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | For cell freezing |
| BD Vacutainer Red Plastic 10 ml | Fisher Scientific | 367820 | For human serum collection |
| Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22ga x 1inch Needle | Fisher Scientific | 354221 | For human serum collection |
| Thrombin, bovine origin | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
| Fibrinogen, bovine origin | Sigma-Aldrich | F8630-5G | For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A3428 | For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
| 6-Aminohexanoic acid | Sigma-Aldrich | 07260-100g | For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4°C. |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
| Transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20°C. |
| Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized | EMD Millipore | SCGPU02RE | For reagent sterilization |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | Dilute in water to 6M |
| 4-Dimethylaminobenzaldehyde | Sigma-Aldrich | 39070-50g | For hydroxyproline assay |
| Chloramine-T trihydrate | Sigma-Aldrich | 402869-100g | For hydroxyproline assay |
| trans-4-Hydroxy-L-proline | Sigma-Aldrich | H54409-100g | For hydroxyproline assay |
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 279544-1L | For hydroxyproline assay |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421-250ml | For hydroxyproline assay |
| Acetic acid, glacial | EMD Millipore | AX0073-9 | For hydroxyproline assay |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | For hydroxyproline assay |
| Toluene, anhydrous | Sigma-Aldrich | 244511-1L | For hydroxyproline assay |
| Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-656 | For hydroxyproline assay |
Referências
- West, D. W., et al. The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments. J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).
- Booth, F. W., Laye, M. J. Lack of adequate appreciation of physical exercise’s complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery. J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).
- Booth, F. W., Hargreaves, M. Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise. J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).
- Shearn, J. T., et al. Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).
- Liu, C. F., et al. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective. Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).
- Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. Tissue engineering of ligaments. Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).
- Bayer, M. L., et al. The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension. Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).
- Guerquin, M. J., et al. Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair. J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).
- Ma, J., et al. Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).
- Hagerty, P., et al. The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments. Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).
- Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments. Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).
- Safdar, A., et al. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Crane, J. D., et al. Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging. Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).
- Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).
- Aswad, H., et al. Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice. Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise. J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).
- Pritzlaff, C. J., et al. Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men. J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).
- Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline. Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).
- Neuman, R. E., Logan, M. A. The determination of hydroxyproline. J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).
- Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface. Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).
- Woessner, J. F. The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).
- Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).
- Lee, C. A., et al. Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments. J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).
- Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone. Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).
- Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations. Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).
- Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading. Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).
- Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6 (2), e16957 (2011).
- Nguyen, T., et al. The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro. Physiol Rep. 2 (6), e12042 (2014).
- Joyner, M. J., Pedersen, B. K. Ten questions about systems biology. J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).
- Joyner, M. J. Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists?. J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).
- Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites (‘entheses’) in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
- Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation. J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).
- Arendt, E., Dick, R. Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature. Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).
