Здесь мы описываем хроматографического пробирного, в сочетании с разделением мобильность ионов пептид прекурсоров, следуют с высоким разрешением (~ 30,000) MS-обнаружение терпеноидные фрагменты для количественной оценки стандартов шипами пептида в моноклональных антител Дайджест.
Анализ низкого уровня (1-100 ppm) белковых примесей (например, хост клетки белки (ВДС)) применения инновационных технологий биотерапевтических белка является сложной пробирного, требующих высокой чувствительности и широким динамическим диапазоном. Масса на основе спектрометрии количественная оценка анализов для белков, как правило, включают переваривания белка следуют реакции мониторинг/несколько селективная реакция, мониторинг (SRM/MRM) количественная оценка пептидов, используя разрешением тандем (Rs ~ 1000) квадрупольный масс-спектрометр. Один из недостатков этого подхода явление интерференции наблюдается, когда пептид интерес имеет «же» прекурсоров и фрагмент массы (с точки зрения значения m/z) как другие совместно eluting пептидов в образце (в окне 1-Da). Чтобы избежать этого явления, мы предлагаем альтернативный масс-спектрометрических подход, высокая избирательность (HS) MRM assay, который сочетает в себе разделение мобильность ионов пептид прекурсоров с высоким разрешением (Rs ~ 30000) MS обнаружения фрагментов пептидов. Мы изучили возможности такого подхода для количественного определения низкого изобилие пептид стандартов шипами в дайджест моноклональных антител (МАБ) и продемонстрировал, что он имеет чувствительность и динамический диапазон (по крайней мере 3 порядков) обычно достигнутого в ГПУ анализ. Все шесть пептид стандартов были обнаружены в концентрациях, как низко как 0.1 Нм (1 femtomole загружены на Хроматографическое столбец ID 2.1-мм) в присутствии высоких изобилие пептид фон (2 мкг МАБ дайджест загружен на-столбца). При рассмотрении МВт кролик фосфорилаза (97,2 кДа), от которого были получены шипами пептиды, LOQ этот assay меньше чем 50 ppm. Относительной стандартных отклонений (RSD) пик областей (n = 4 реплицирует) были меньше, чем 15% в диапазоне всего концентрация расследование (0,1-100 Нм или 1-1000 ppm) в этом исследовании.
Количественная оценка крупных биомолекул (белков) в промышленных условиях в настоящее время основывается на immunoassays (например, ELISAs), главным образом из-за ряда преимуществ: чувствительность, высокой пропускной способности, простота использования и низкая стоимость на сэмпл. При применении для анализа низкой обилие белковых примесей (1-100 ppm-клетки хозяина белков (ВДС)) в терапии белка, эти биологические анализы обычно предоставляют общую концентрацию HCP (обычно выражается в ppm или нг HCP/мг МАБ), но они не удается определить и оценить отдельные загрязнители HCP. Недавно были подготовлены несколько анализов на основе MS для дополнения ELISAs или предоставлять информацию, что ELISAs не предлагать1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. Ввиду сложности образца и требование для обнаружения HCP пептиды через широкий динамический диапазон концентрации (по крайней мере 3 порядков), имеют многомерные Хроматографические методы торгов обширной выборки фракционирования традиционно использовались для выявления низкого обилие ВДС1,2,3,4,5,6,7.
Естественный шаг после HCP идентификации и проверки является HCP отслеживание (мониторинг) через несколько серий биофармацевтики. В этой ситуации были предложены методы одномерного LC/МС для улучшения образца пропускной способности8,9. Однако точность и динамический диапазон HCP измерений могут быть затронуты в assay LC/МС 1D подавляющее присутствие биофармацевтической пептиды. По сравнению с многомерной разделения, потенциал для сигнала помехи19,20,,2122 увеличивается в одномерных хроматографического разделения потому что вероятность больше пептид прекурсоров будет совместно eluting увеличивается. Включение ортогональных средств для разделения пептид прекурсоров без продления хроматографического разделения времени явно бы выгодным. Путешествия волны ионной подвижности (TWIM)10 имеет возможность разрешения перегруженных МС спектры в миллисекундах. Около 500 цветоделение мобильности может быть выполнена во время элюции одного пептид, предполагая полную хроматографического пика шириной 10 s и учитывая, что среда выполнения им разделения на инструменте подвижности ионов 20 мс.
Масс-спектрометрических анализов для количественного определения белка были успешно разработаны в последние десятилетия с использованием общепринятых выбран (несколько) реакции, мониторинг подход (SRM/MRM метод) реализован на тандеме масс-спектрометров11, 12,13,14,,1516,,1718,19,20,21 ,,22–23. Одним из ограничений этот разрешением масс-спектрометрических assay является вмешательство явление19,20,21,22 наблюдается при пептид интерес имеет «же» прекурсоров и фрагмент массы других совместно eluting пептиды представляют в образце (в окне 1-Da). Существует два способа для улучшения точности методов SRM/Записями: один вариант предусматривает дополнительное разделение шаг на уровне прекурсоров для удаления мешающих ионов прекурсоров, в то время как другой вариант заключается в том, чтобы увеличить разрешение MS прекурсоров/фрагмент обнаружения для Избегайте перекрывающихся MS сигналов. Высокоизбирательные Записями (HS) приобретение режим описано здесь использует оба этих подхода, связывая разделение мобильность ионов пептид прекурсоров с высоким разрешением (Rs ~ 30000) MS обнаружения фрагментов пептидов. Assay описано здесь охватывает, по меньшей мере трех порядков, которые это динамический диапазон обычно наблюдается в SRM/MRM протеомики эксперименты17,18,24.
Утилита assay HS-Записями для квантификации HCP свидетельствует мониторинг линейность сигнала, производимые шесть стандартов пептид, шипами в различных концентрациях (диапазоне 0.1 – 100 Нм) в дайджест моноклональных антител.
С высоким разрешением (Rs > 20000) масс-спектрометрия регулярно используется для структурных характеристик терапевтических белков на различных платформах инструмента. В отличие от количественной оценки на основе MS белка производится обычно SRM/Записями на низком (~ 1 000 рупий) тандем квадрупольного масс-спектрометров с помощью подписи пептиды, порожденных ферментативного расщепления белков11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. как одномерные хроматографического цветоделение не удается разрешить полностью комплекс пептидных смеси производится путем ферментативного пищеварения, пептид совместное Элюирующий является обычным явлением, даже в случае одного белка дайджест. Для очень сложных белков дайджесты (например, для количественной оценки 1-100 ПМП ВДС присутствии пептид богатый фон, производимые терапевтических белков), чувствительность, точность или линейности SRM MRM пробирного могут быть затронуты помех.
SRM/MRM анализов у одномерного избирательности, полагаясь только на «уникальный» сочетание прекурсоров/фрагмент масс. По этой причине, эти анализы не в ситуациях, когда неожиданно изменяется фон пептида (например, для биофармацевтической образцов, полученных из различных очистительных процедур). Чтобы преодолеть эти ограничения, мы предлагаем здесь высокоизбирательные пробирного (HS) MRM, реализованы на Ион мобильности с поддержкой высокого разрешения квадрупольного время полета (QTOF) гибридный масс-спектрометр (для документа схемы, см. рисунок 6).
Инструмент отделяет прекурсоров пептид интерес от других совместно eluting (помехи) пептида прекурсоров в мобильности литиевого, изолирует полный изотопный конверт прекурсоров в квадрупольного и фрагменты его с фиксированной CE в ячейка столкновения. Сигнал от его наиболее распространенным Пептидный фрагмент усиливается, регулируя частоту толкателя (цель расширения), которые выборочно толкает массового регионы интереса в рейс трубки, а не всех ионов, как с полного сканирования. Пептид количественная оценка осуществляется с использованием сигналов высокой MS-резолюции (Rs ~ 30000), производимые этот фрагмент Ион. По сравнению с SRM/MRM анализов, HS-мно assay предлагает две дополнительные уровни избирательность: один обеспечивается Ион прекурсоров уровень мобильности разделения, в то время как второй обеспечивается увеличение массы резолюции TOF анализатора. Результаты принес эти избирательности улучшения видны в HS-мно хроматограммы отображены на рисунке 7, которые свободны от помех через трех порядков.
В отличие от SRM/MRM анализов, есть несколько параметров, которые могут корректироваться для оптимизации анализов HS-мно: RT окна вокруг предвестником пептида (обычно устанавливается в 0,2 мин), квадрупольного изоляции окна (4 Да), окна во время дрейфа вокруг прекурсоров (± Полувысоте пика прекурсоров из соответствующего Ион mobilogram) и резолюции МС фрагмент Иона (20 000-40 000). HS-мно анализов очень чувствительны: низкая обнаруженных для каждого Пхо пептиды составляет 1 femtomole на столбец (или 0,1 нм с точки зрения концентрация пептидный). При рассмотрении пептид МВт (см. таблицу 1 для точной MWs), сумма обнаружено на столбец порядка 1-2 стр., в то время как столбец загружается с значительно большее количество фон пептидов в дайджесте МАБ (2 мкг).
Рассматривая молекулярный вес полнометражного Пхо белка (97,2 кДа), из которого были получены шипами пептиды, assay может обнаружить 50 ppm белковых примесей в присутствии ионов высокой изобилие фон. Ниже пределов обнаружения (5-10 ppm) достижимы для ниже, молекулярным весом ВДС (10-20 кДа). Assay охватывает три порядков (как показано в калибровочных кривых на рисунке 8), что означает, что он может измерять ВДС в диапазоне 1-1000 ppm. Кроме того воспроизводимость анализов HS-МНО, показано в таблице 3, очень хорошо соответствует воспроизводимость анализов мелкомолекулярных SRM/MRM, с площади пика RSDs лучше, чем на 15%.
Мы изучили возможности Роман assay для количественного определения стандартов шипами пептида в дайджест моноклональных антител (МАБ) и продемонстрировал его чувствительность и утилита для обычно охватывают широкий динамический диапазон (по крайней мере трех порядков) При анализе HCP. Все шесть пептид стандартов были обнаружены в концентрациях, как низко как 0.1 Нм (1 femtomole загружены на Хроматографическое столбец ID 2.1-мм) в присутствии высоких изобилие пептид фон (2 мкг МАБ дайджест загружен на-столбца). Путем включения целевых HRMS и ионной подвижности прекурсоров разделения, HS-мно assay имеет большой потенциал для стать быстрый, высок объём пробирного контроля для нескольких ВДС через несколько серий биофармацевтики.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Лесли Malouin и Тони Catlin от вод корпорации за подготовку рисунок 6 рукописи.
Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
LC vials (12×32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
Protein LoBind 2.0 mL tubes (2×50) | Eppendorf | 22431102 | |
RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |