Her, beskriver vi et kromatografisk analyse kombineret med ion mobilitet adskillelse af peptid prækursorer efterfulgt af høj opløsning (~ 30.000) MS-påvisning af peptid fragmenter for kvantificering af spidse peptid standarder i et monoklonalt antistof Digest.
Analyse af low-level (1-100 ppm) protein urenheder (f.eks. vært-cellen proteiner (HCPs)) i protein biotherapeutics er en udfordrende assay, der kræver høj følsomhed og bredt dynamikområde. Massespektrometri-baseret kvantificering assays til proteiner typisk involverer protein fordøjelse efterfulgt af den selektive reaktion overvågning/flere reaktion overvågning (SRM/MRM) kvantificering af peptider ved hjælp af en lav opløsning (Rs ~ 1.000) tandem Quadrupol massespektrometer. En af begrænsningerne i denne tilgang er interferens fænomen observeret når peptid interesse har “samme” forløber og fragment masse (målt i m/z-værdier) som andre Co fremstilling peptider til stede i prøven (inden for en 1-Da vindue). For at undgå dette fænomen, foreslår vi en alternativ massespektrometrisk tilgang, en høj selektivitet (HS) MRM assay, der kombinerer ion mobilitet adskillelse af peptid forstadier med høj opløsning (Rs ~ 30.000) MS påvisning af peptid fragmenter. Vi udforsket mulighederne i denne tilgang til at kvantificere lav-overflod peptid standarder spidse i et monoklonalt antistof (mAb) digest og demonstreret, at det har den følsomhed og dynamikområde (mindst 3 ordrer størrelsesorden) typisk opnået i HCP analyse. Alle seks peptid standarder blev fundet i koncentrationer, der er så lav som 0,1 nM (1 femtomole lastet på et 2.1-mm ID kromatografiske kolonne) under tilstedeværelse af en høj-overflod peptid baggrund (2 µg af en mAb digest indlæst på kolonne). Når man overvejer MW af kanin phosphorylase (97.2 kDa), som de spidse peptider er fremstillet, er LOQ af denne analyse lavere end 50 ppm. Relative standardafvigelser (RSD) af toparealer (n = 4 replikater) var mindre end 15% på tværs af det hele koncentrationsområde undersøgt (0,1-100 nM eller 1-1.000 ppm) i denne undersøgelse.
Kvantificering af store biomolekyler (proteiner) i industrielle indstillinger er i øjeblikket baseret på immunassays (fx ringprøver), hovedsagelig på grund af flere fordele: følsomhed, høj overførselshastighed, lethed-i-brug og lave omkostninger pr. prøve. Når den anvendes til at analysere de lav-overflod protein urenheder (værts-celle proteiner (HCPs) 1-100 ppm) findes i protein therapeutics, give disse biologiske assays typisk den samlede HCP koncentration (normalt udtrykt i ppm eller ng HCP/mg mAb), men de ikke kan identificere og måle individuelle HCP forurenende stoffer. Flere MS-baserede assays er for nylig blevet udviklet til at supplere ringprøver eller levere oplysninger, ringprøver undlader at tilbyde1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. prøve kompleksitet og kravet om at afsløre HCP peptider på tværs af et bredt dynamikområde i koncentration (mindst 3 ordrer størrelsesorden), flerdimensionelle kromatografiske metoder udbud omfattende stikprøve fraktionering har traditionelt været ansat til at hjælpe med at identificere low-overflod HCPs1,2,3,4,5,6,7.
Et naturligt skridt efter HCP identifikation og validering er HCP tracking (overvågning) på tværs af flere partier af biofarmaceutiske. I denne situation, er single-dimension LC/MS metoder blevet foreslået at forbedre prøve overførselshastighed8,9. Men, nøjagtighed og dynamiske rækkevidde af HCP målinger kan blive påvirket i en 1D LC/MS analyse af den overvældende tilstedeværelse af biofarmaceutiske peptider. Sammenlignet med en multidimensional adskillelse, potentialet for signal interferens19,20,21,22 er øget i en enkelt dimension kromatografisk separation fordi sandsynligheden for flere peptid prækursorer skal Co fremstilling er steget. Indarbejdelse af ortogonale middel til at adskille peptid prækursorer uden at udvide den chromatografiske separation tid ville klart være en fordel. Rejser bølge ion mobilitet (TWIM)10 har kapacitet til at løse overbelastede MS spektre i millisekunder. Ca. 500 mobilitet separationer kan udføres under eluering af en enkelt peptid, forudsat at en fuld kromatografiske toppe bredde på 10 s og overvejer at runtime af en IM adskillelse på ion mobilitet instrument er 20 ms.
Massespektrometrisk assays til protein kvantificering er udviklet med held i løbet af sidste årti bruger det godt accepteret valgt (flere) reaktion overvågning tilgang (SRM/MRM metode) gennemført på tandem massespektrometre11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. En af begrænsningerne i denne opløsning massespektrometrisk assay er den indblanding fænomen19,20,21,22 observeret når peptid interesse har det “samme” forløber og fragment masse andre Co fremstilling peptider til stede i prøven (inden for en 1-Da vindue). Der er to måder at forbedre nøjagtigheden af SRM/MRM metoder: en mulighed omfatter et ekstra adskillelse skridt på niveauet forløber fjerne interfererende forløber ioner, mens anden muligheden er at øge MS opløsningen af forløber/fragment påvisning at undgå overlappende MS signaler. Høj selektivitet (HS) MRM erhvervelse mode beskrevet her tager fordel af begge disse tilgange ved at koble ion mobilitet adskillelse af peptid forstadier med høj opløsning (Rs ~ 30.000) MS påvisning af peptid fragmenter. Analysen beskrives her dækker mindst tre størrelsesordener, som er den dynamiske område typisk observeret i SRM/MRM proteomics eksperimenter17,18,24.
Nytte af HS-MRM analysen til HCP kvantificering blev demonstreret ved at overvåge lineariteten af signalet produceret af seks peptid standarder spiked ved forskellige koncentrationer (0,1 – 100 nM rækkevidde) i et monoklonalt antistof digest.
Høj opløsning (Rs > 20.000) massespektrometri bruges rutinemæssigt til strukturel karakterisering af terapeutiske proteiner på en række instrument platforme. Derimod er MS-baseret protein kvantificering typisk udføres af SRM/MRM om lav opløsning (Rs ~ 1.000) tandem Quadrupol massespektrometre ved hjælp af underskrift peptider genereret af enzymatisk kløvningen af proteiner11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. som single-dimension kromatografisk separation ikke kan fuldt løse komplekse peptid blandinger fremstillet af enzymatisk fordøjelse, peptid Co eluering er en fælles begivenhed, selv i tilfælde af en single-protein digest. Meget komplekse protein fordøjer (f.eks. til kvantificering af 1-100 ppm af HCPs i overværelse af et peptid-rige baggrunden produceret af den terapeutiske protein), følsomhed, nøjagtighed og linearitet SRM/MRM kan assay blive påvirket af interferens.
SRM/MRM assays har endimensional selektivitet, kun påberåbe sig en “unik” kombination af forløber/fragment masserne. Derfor, disse assays mislykkes i situationer når peptid baggrunden ændres uventet (f.eks. for biofarmaceutiske prøver fremstillet af forskellige rensning procedurer). For at overvinde disse begrænsninger, vi foreslår her en høj selektivitet (HS) MRM analysen gennemføres på en ion mobilitet-aktiveret høj opløsning Quadrupol time of flight (QTOF) hybrid mass spectrometer (for instrument-diagram se figur 6).
Instrumentet adskiller forløbere for peptid af interesse fra andre Co fremstilling (interfererende) peptid prækursorer i cellen ion mobilitet, isolerer forløber i Quadrupol fuld isotopiske konvolutten og fragmenter det med en fast CE i den kollision celle. Signalet produceret af dens mest rigelige peptid fragment er yderligere forbedret ved at justere en pusher frekvens (Target ekstraudstyr), der selektivt skubber masse regioner af interesse i flight røret i stedet for alle ioner, som med en fuld scanning. Peptid kvantificering udføres ved hjælp af high-MS-opløsning (Rs ~ 30.000) signaler produceret af dette fragment ion. Sammenlignet med SRM/MRM assays, HS-MRM assay tilbyder to yderligere niveauer af selektivitet: en tilbydes af forløber-niveau ion mobilitet adskillelse, mens andet er tilbudt af den øgede masse opløsning af TOF analyzer. Resultaterne af forbedringerne selektivitet er synlige i HS-MRM kromatogrammer vises i figur 7, som er fri for interferens på tværs af tre størrelsesordener.
I modsætning til SRM/MRM-assays, der er flere parametre, der kan justeres for at optimere HS-MRM assays: vinduet RT omkring peptid forløber (typisk fastsat til 0,2 min.), vinduet Quadrupol isolation (4 Da), vinduet drift-tid omkring den forløber (± FWHM af forløber peak fra den tilsvarende ion mobilogram), og MS opløsning af fragment ion (20.000-40.000). HS-MRM-assays er meget følsomme: de laveste fundne beløb for hver PHO peptider er 1 femtomole på-kolonne (eller 0,1 nM i form af peptid koncentration). Når man overvejer peptid MW (se tabel 1 for nøjagtig MWs), beløbet, der registreres på kolonnen er på rækkefølgen af 1-2 pg, mens kolonnen er fyldt med et betydeligt højere beløb (2 µg) af baggrunden peptider fra mAb digest.
Ved at betragte molekylvægt af fuld længde PHO protein (97.2 kDa) som blev fremstillet af de spidse peptider, er analysen købedygtig opdager 50 ppm af en protein urenhed i overværelse af høj-overflod baggrund ioner. Lavere påvisningsgrænser (5-10 ppm) er opnåelige for lavere molekylvægt HCPs (10-20 kDa). Analysen omfatter tre størrelsesordener (som vist i kalibreringskurverne fra figur 8), hvilket betyder, at det kan måle HCPs i området 1-1.000 ppm. Også, reproducerbarhed af HS-MRM assays, illustreret i tabel 3, svarer meget godt med reproducerbarhed af små-molekyle SRM/MRM assays, med topareal RSDs bedre end 15%.
Vi udforsket mulighederne i en roman analyse til kvantificering af spidse peptid standarder i en monoklonale antistof (mAb) digest og demonstreret sin følsomhed og værktøj til at dække bredt dynamikområde (mindst tre størrelsesordener) typisk stødt i HCP analyse. Alle seks peptid standarder blev fundet i koncentrationer, der er så lav som 0,1 nM (1 femtomole lastet på et 2.1-mm ID kromatografiske kolonne) under tilstedeværelse af en høj-overflod peptid baggrund (2 µg af en mAb digest indlæst på kolonne). Ved at inkorporere både målrettede HRMS og ion mobilitet forløber adskillelse, har HS-MRM analysen stort potentiale for at blive en hurtig, høj overførselshastighed overvågning assay for flere HCPs på tværs af flere partier af biofarmaceutiske.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Lesley Malouin og Tony Catlin fra farvande Corporation for at forberede figur 6 af manuskriptet.
Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
LC vials (12×32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
Protein LoBind 2.0 mL tubes (2×50) | Eppendorf | 22431102 | |
RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |