液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

1. インフリキシマブ ダイジェスト (〜 24 時間手続き) の準備 重炭酸アンモニウム 50 ミリメートル、50 ミリメートル NH4HCO3, 500 mM ジチオトレイトール (DTT) 50 mM NH4HCO3と 50 mM NH4HCO3で 500 mM ヨードアセトアミド (IAM) の 1% アニオン界面活性剤の新鮮なソリューションを準備します。 50 mM NH4HCO3750 μ L、インフリキシマブ mAb (10 mg/mL) 200 μ L と 1% アニオン界面活性剤溶液 50 μ L を追加し、0.05% アニオン界面活性剤の存在下で 60 ° C で 15 分のタンパク質を変性します。 500 mM DTT の 40 μ L を追加し、20 mM DTT 存在下で 60 ° C で 60 分のサンプリングを軽減します。 500 mM IAM の 20 μ L を追加し、アルキレート 〜 10 mM IAM の存在下で暗闇の中で部屋の温度で 30 分のサンプル。 MS シーケンス グレード Lys C/トリプシンの 20 μ g を含むバイアルに遠心チューブの内容を追加し、37 ° C で 3 時間サンプルをダイジェスト MS シーケンス グレード Lys C/トリプシンのダイジェスト サンプル一晩 (12-15 h) 37 ° C で 20 μ g が含まれている別のバイアルに消化されたサンプルを転送することによって第二の酵素分注 (20 μ g) を追加します。 夜通し分解後 100% ギ酸 (FA) の 5 μ l 添加し酸不安定なアニオン界面活性剤を分解する 37 ° C で 30 分間のダイジェストを孵化させなさい。 アニオン界面活性剤の不溶性成分の沈殿物を遠心分離機で 4,000 x g で 15 分のダイジェストをスピンダウンします。 インフリキシマブ ダイジェスト 〜 1,000 μ L を回復し、LC – オートサンプラー バイアル。ダイジェスト濃度は、〜 2 mg/mL をする必要があります。LC/MS システム解析の準備が整うまでは、-20 ° C で冷凍庫でダイジェストを格納します。 2. スパイク ペプチド標準 (30 分程度) 室温でベンチにガラス瓶で冷凍のサンプルを置くことによってインフリキシマブ ダイジェストを解凍します。 フォーからのすべての 6 ペプチド標準原液 1 μ M を準備する H2O 1 つウサギ ホスホリラーゼ b (フォー) ダイジェスト バイアルで FA (バイアルが含まれています各ペプチドの 1 nmol には) バイアルに含まれている 0.1 %1 mL を追加します。 準備 4 x 1 mL 希釈溶液 0.1、1、10、および 100 nM ペプチド、0.1% を使用してを取得するフォー原液の希釈溶剤として FA。ガラス瓶 (LC 自動サンプラー バイアル) ですべての希釈を準備し、背景のマトリックスとしてすべてのバイアルにインフリキシマブ ダイジェストの 100 μ L を追加します。各 10 μ L 注入ダイジェスト背景に段の 2 μ g をロードします。希薄化後インフリキシマブ ダイジェストを含む空白のサンプルを準備 (、同じ 1:10 希釈)、ないスパイク ペプチド。 3. LC/焦点電子データ取得方法のセットアップ メモ: ワークフロー HS MRM 集録のセットアップに必要な手順をまとめた図 1 に描かれている、詳細セクション 3-6 に記載されています。各監視対象ペプチド、エレクトロ スプレー イオン化を次の最も豊富なペプチド イオンの親 m/z の保持時間を確立するデータに依存しない焦点Eデータセットの取得が必要し、対応する CCS (衝突クロスセクション) はイオン移動度の分離から派生します。さらに、データに依存しない dataset は、各ペプチド前駆体の 3 つの最も豊富なフラグメント イオンの m/z に関する情報を提供します。ワークフロー (CE 最適化) の 2 番目の手順では、アッセイの感度は各フラグメント イオンの高いイオン強度を得るために衝突細胞エネルギーをチューニングすることによって増加します。最後に、最後の手順で上記のすべてのパラメーターは監視各ペプチド HS MRM メソッド エディターを紹介します。 四重極飛行時間 (QTOF) 質量分析計データに依存しない取得法 (焦点E) を用いた超高性能液体クロマトグラフィー システムを結合の LC/MS 測定実験を行います。注: 楽器の構成に関する詳細については、材料のセクションに含まれます。この楽器は、ペプチド前駆体10の分離のための旅行波イオンのモビリティのデバイスを使用します。 準備 0.1% 水 (溶媒) で FA および 0.1% を含む 2 つの移動相アセトニ トリル (溶剤 B) で FA。注: は、スパイク mAb ダイジェストの分離の荷電表面ハイブリッド (CSH) C18 カラム (2.1 × 150 mm、充填 1.7 μ m 粒子) を使用します。 データ集録ソフトウェア「作成/分析法」をクリックしてし「買収の生成と処理方法」を選択メソッド名を入力、メソッド フォルダー (ディレクトリ) を参照し、「次へ」をクリックしてください 「分析型」の「ペプチド マップ (IMS)、”を選択し、”楽器システム”タブで「第四紀溶剤マネージャー」計測器を選択します。200 μ L/分使用溶剤 B 30 分は続く 2 分列洗浄 40 %1 からグラジエントの流量でペプチドの分離を達成するためにグラデーションの設定を編集し、50 分の総ランタイムでの 9 分平衡をこれらの実験的導入LC メソッド エディターのパラメーター。 「楽器システム」タブで「サンプル マネージャー」計測器を選択します。カラム温度 60 ° c と 10 ° C にサンプル温度を設定します。 正イオン ESI 感度モード、30,000 の半値幅の典型的な解像力 QTOF 質量分析計を動作します。注: LC/焦点Eは急速に (衝突の細胞) に衝突エネルギーを交互にスキャンを集めることによって動作するデータ集録 (DIA) モード (MS チャネル 1 スキャンの 6 V) の低エネルギーと高エネルギー (15-40 V ランプにMS チャネル 2 の前駆体選択なし断片化スペクトルを生成します)。 データ集録ソフトウェアのデフォルト ソース関連 MS パラメーターを入力:「私の仕事/楽器システム、」”ヴィオン IMS Qtof”タブを選択「ツール」メニューでこれらのパラメーターを入力から: 3.0 kV キャピラリー電圧、100 ° C ソース温度、100 V のソースオフセット、50 L/h 円錐コーン電圧 40 V と流れ。脱溶媒温度を 250 ° C、500 L/h、脱溶媒ガス流量および 3.0 にキャピラリー電圧に設定 kV。 データ集録ソフトウェア「作成/分析法」をクリックしてし「買収の生成と処理方法」を選択メソッド名を入力メソッド フォルダー (ディレクトリ) を参照し、「次へ」をクリックしてください 「分析型」の「ペプチド マップ (IMS)、”を選択し、”楽器システム”タブで”ヴィオン IMS QTof”計測器を選択します。「完了」をクリック注: 新しく作成された LC/焦点Eメソッドは「楽器法の構成」画面自動的に開きます。 「設定」タブでこれらのパラメーターを入力: 3.0 kV キャピラリー電圧、100 ° C ソースの温度溶媒温度を 250 ° C、50 L/h 円錐形ガス フロー、および 500 L/h 脱溶媒ガスの流れ。 「実験」タブの設定で「高精細 MSE」を選択し「分析法ランタイム」を選択「スキャン設定」タブでこれらパラメーターを入力: 質量 100;高質量、2,000;スキャン時間、400 さん「CE」タブで、「6 V」の省エネ設定を入力し「無効データ縮小」チェックがあることを確認 (動) 40 15 から高エネルギー ランプを選択します。 50 ng/mL ロイシン エンケファリン (ル) 0.1% と 50% アセトニ トリルで準備のソリューションを吹き込むデータ集録中にロック質量校正用 10 μ L/分の流量で FA。注: 同じ質量範囲にわたって同じレートを使用して 5 分ごとロック-大量のデータを取得します。 (読み込まれている量の列は各ペプチド標準 100 fmol) サンプルの 10 μ L 注入によって上記 LC/焦点Eアッセイを用いた 10 nM、フォー スパイク サンプルを分析します。 4. 衝突エネルギー (CE) 最適化法 Tof MRM のセットアップ LC/焦点Eデータセットから各フォー ペプチド フラグメント イオン m/z、前駆体、リテンション時間を取得します。M/z との最も豊富な充電状態を保持フラグメント イオンを前駆イオンと対応する 3 つの最も豊富な。注: 通常 LC/焦点Eアッセイによって記録される低エネルギーと高エネルギーのスペクトルの例は図 2 の表示です。 SRM/MRM 実験で衝突エネルギー (CE) の最適化を使用して、各ペプチド23の最高の信号を取得します。 データ集録ソフトウェア「作成/分析法」をクリックしてし「買収の生成と処理方法」を選択メソッド名を入力、メソッド フォルダー (ディレクトリ) を参照し、「次へ」をクリックしてください 「分析型」の「数量」を選択「数量アッセイ Tof 2次元クロマトグラフィー”を選択し、”次へ”をクリックしてください「楽器システム」タブで「ヴィオン IMS QTof」を選択し、「完了」をクリック注: 新しく作成された Tof MRM メソッドは「楽器法の構成」画面自動的に開きます。 「設定」タブでこれらのパラメーターを入力: 3.0 kV キャピラリー電圧、100 ° C ソースの温度溶媒温度を 250 ° C、50 L/h 円錐形ガス フロー、および 500 L/h 脱溶媒ガスの流れ。 「実験」タブの設定で「関数テーブル」を選択し、「1 つまたは複数 MS、MSM、MRM 関数」各ペプチド「Tof MRM」機能を設定する 3「切り替え効果」(最も豊富な前駆体とその最も豊富なフラグメント イオンの 3 つの組み合わせ) を入力して下向きの矢印を使用して。注: Tof MRM では、最高感度が得られますスケジュールされた MRM アプローチ。 「Tof MRM」関数エディターでペプチドの溶出順序に従って整理される各ペプチド (少なくとも 1 分)、1 つの保持時間ウィンドウを選択します。「Tof MRM」関数エディターで挿入ペプチド前駆体 m/z と製品 m/z;ペプチド前駆体; の「低」(4 Da ウィンドウ) としてクワッド分離ウィンドウを選択します。100 ms; 固定スキャン時間を選択します。14-36 V の範囲で 12 の異なる衝突エネルギー値を次のように選択と: 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、および 36、図 3 の例で示すように。注: 上記 Tof MRM 法、クロマトグラフィーのピークあたり少なくとも 10 のデータ ポイントは指定各 CE の各遷移に対して収集されます。データ ファイルのサイズを減らすためには、フラグメント イオンの信号 (6 Da ウィンドウ) の「ワイド」のオプションを選択します。CE 最適化値の例を表 2 に示します。 (読み込まれている量の列は各ペプチド標準 100 fmol) サンプルの 10 μ L 注入によって上記 Tof MRM アッセイを用いた 10 nM、フォー スパイク サンプルを分析します。 5. 最終 HS MRM 買収ペプチド前駆体のイオン移動度の分離を使用したペプチドの定量化法のセットアップ データ集録ソフトウェアの「調査」メニューのすべてのペプチドの各 CE 用に生成されたすべての 11 ガスクロマト グラフ トレースを表示し、「処理オプション/操作」ツールバーから「統合」ボタンを使用してピークを統合最高のピーク領域は、各遷移に対して最高の CE を示されます。 3 各ペプチド断片の最高のピーク面積を比較し、保持は最高の「移行」(フラグメント イオン最も強烈な信号を生成する);表 2 には、最高 4 つのフォー ペプチドから得られる「切り替え効果」が表示されます。 ペプチドあたり 1 つだけのフラグメント イオンを含む HS MRM メソッドをセットアップします。LC/焦点Eデータセットから各ペプチド前駆体の CCS の値を使用します。 前のセクション (セクション 4) で作成した Tof MRM メソッドを修正するには、「Tof MRM」関数ではなく「HS MRM」関数を選択します。 「HS MRM」関数エディターで次の前駆体関連パラメーターを入力: m/z、四重極の解像度: (4 Da) を低、充電状態、前駆体 CCS 値および前駆体 CCS 解像度: 低。製品イオンその m/z、最適な衝突エネルギーを入力、0.4 s の選択スキャン時間を選択に含めるすべての同位体の「ワイド」スペクトル設定 (6 Da)。すべての 4 つのペプチド最終 HS MRM 獲得手法の例である図 4. します。 サンプルの分析すべて空白の mAb のダイジェストから始まる HS MRM メソッドを使用して (非スパイク サンプル)、4 複製注射 (各 10 μ L) 以下の濃度の続く: 0.1、1、10、および 100 nM フォー ペプチド。 6. HS MRM データセットの解析処理手法の作成 HS MRM データセットの分析のための処理メソッドを作成します。 「HS MRM」データ取得メソッドは、分析法、「目的」タブをクリックして「コンポーネントを管理」を選択、 下「実験型」ドロップ ダウン メニューから「HS MS/MS/HS MRM」オプションを選択します。 「作成/新規エントリ」をクリックしてし、処理メソッド エディターで以下パラメーターを紹介: ペプチド保持時間 (RT) 前駆体充電状態、前駆体 m/z、および前駆体ドリフト時間 (DT).フラグメント イオンの質量と電荷の状態を入力し、抽出モードとして”XIC”トレースを指定します。 同じ「HS MRM」獲得法「目的」タブ、「初期設定額」をクリックしてし下記の濃度を入力: 0.1、1、10、および 100 nM フォー ペプチド。 「処理/抽出設定」で以下のパラメーターを入力してください: デフォルトの質量許容値、10 ppm (すべてのフラグメント イオンの m/z) の時、5% のドリフトの既定フォー ペプチドの処理方法の例については、図 5 に示すです。 校正型線形カーブ フィット 1/2加重 X を選択します。 HS MRM データすべてのクロマト グラムを統合し、各フォー ペプチドの検量線を作成するプロセス。