अध्ययन के लिए प्राथमिक सिलिया प्राथमिक neurosphere संस्कृति का उपयोग करना
Summary
प्राथमिक पपनी तंत्रिका पूर्वज कोशिका प्रसार, neuronal भेदभाव, और वयस्क न्यूरोनल समारोह में मूल रूप से महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम ciliogenesis और प्राथमिक neurosphere संस्कृतियों का उपयोग कर तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और विभेदित न्यूरॉन्स में सिलिया के लिए प्रोटीन संकेत की तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन।
Abstract
The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.
Introduction
प्राथमिक पपनी एक सूक्ष्मनलिका आधारित गतिशील subcellular डिब्बे है कि भ्रूण neuronal विकास 1, 2 के दौरान ध्वनि Hedgehog (श्श्श) मार्ग सहित सेलुलर संकेत दे रास्ते, समन्वय में एक संवेदी एंटीना, और वयस्क न्यूरोनल समारोह 3 में बंटे subcellular सिगनल, 4 के रूप में कार्य । इस तरह के श्श्श रिसेप्टर समझौता 5 के रूप में इन रास्ते, के घटक संकेत; मार्ग उत्प्रेरक smoothened (एसएमओ) 6; और Gpr161 7, एक अनाथ जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) को नकारात्मक रूप श्श्श मार्ग को नियंत्रित करता है, सिलिया के लिए एक गतिशील फैशन में स्थानीय बनाना। एकाधिक GPCRs मस्तिष्क 7, 8, 9, 10 में न्यूरॉन्स में सिलिया को स्थानीय बनाना सूचित किया गया है </sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16। सिलिया और सिलिया-उत्पन्न संकेत रास्ते में दोष कई ऊतकों को प्रभावित और सामूहिक रूप से ciliopathies 17, 18, 19 के रूप में जाना जाता है। Ciliopathy रोग स्पेक्ट्रम अक्सर इस तरह के craniofacial असामान्यताएं 20, 21, 22 के रूप में neurodevelopmental दोष, भी शामिल है। इसके अलावा, हाइपोथेलेमिक न्यूरॉन में प्राथमिक सिलिया केंद्रीय तृप्ति रास्ते को विनियमित, और दोषों केंद्रीय मोटापा 23 में परिणाम, इस तरह के बार्डेट Biedel सिंड्रोम 24 के रूप में स्यन्द्रोमिक ciliopathies में मोटापे को प्रतिबिंबित। इसके अलावा, न्यूरोपेप्टाइड रिसेप्टर सिलिया में संकेत centr को नियंत्रित करता हैअल तृप्ति 11 रास्ते, 14। इस तरह के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में सोमेटोस्टैटिन रिसेप्टर 3 के रूप में adenylyl cyclase तृतीय (ACIII) और GPCRs के सिलिअरी स्थानीयकरण उपन्यास वस्तु की पहचान दोषों और स्मृति घाटे 25, 26 में परिणाम और रोमक अखंडता 27 की कमी समानताएं। सिलिया-उत्पन्न संकेत के विकास के पहलुओं को बारीकी से ऊतक homeostasis से बंधा रहे हैं; विशेष रूप से, सिलिया सेरिबैलम 28, 29 में ग्रेन्युल पूर्वज से उत्पन्न होने वाली श्श्श-उप प्रकार medulloblastomas की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार, प्राथमिक सिलिया भ्रूण, प्रसव के बाद, और वयस्क न्यूरोनल विकास और समारोह के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) subventricular क्षेत्र पार्श्व वेंट्रिकल की (SVZ), हिप्पोकैम्पस के देंताते जाइरस की subgranular क्षेत्र, और में रहते हैंस्तनधारियों 30, 31, 32 में हाइपोथेलेमस में तीसरे निलय की निलय क्षेत्र। एनएससी, multipotent हैं आत्म नवीकरण के लिए क्षमता के अधिकारी, और मस्तिष्क के विकास और पुनर्योजी चिकित्सा 30 के लिए महत्वपूर्ण हैं। SVZ में अधिकांश एनएससी मौन कर रहे हैं और एक एकान्त प्राथमिक पपनी कि, कई मामलों में, पार्श्व वेंट्रिकल 33 के लिए बाहर फैली हुई है मेरे पास है। विभिन्न रिसेप्टर्स की स्थानीयकरण, नीचे की ओर सेलुलर प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरण, विशेष रूप से श्श्श, TGFβ, और रिसेप्टर tyrosine kinase रास्ते 2, 34, 35, 36 के संबंध में के माध्यम से प्राथमिक पपनी संकेत है। के बाद से प्राथमिक सिलिया पार्श्व निलय में विस्तार, यह धारणा है कि प्राथमिक सिलिया मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) एनएससी 37 सक्रिय करने के लिए साइटोकिन्स का पता लगाने के </s> ऊपर। हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि श्श्श संकेतन मार्ग और प्राथमिक सिलिया की मरम्मत में स्टेम कोशिकाओं की सक्रियता और घ्राण उपकला, फेफड़े, और गुर्दे की 38, 39, 40, 41 सहित कई ऊतकों के उत्थान के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, जो सीएसएफ से तंत्र एनएससी के साथ संचार और क्या प्राथमिक सिलिया शामिल कर रहे हैं ज्ञात नहीं हैं। संस्कृति में पक्षपाती एनएससी रोमक कर रहे हैं; स्थानीय बनाना इस तरह के एसएमओ और Gpr161 सिलिया में के रूप में श्श्श मार्ग घटकों,; और श्श्श उत्तरदायी 42 कर रहे हैं। इस प्रकार, एनएससी श्श्श मार्ग का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली, सिलिअरी की तस्करी, और neuronal भेदभाव रास्ते के रूप में काम कर सकते हैं। इसके अलावा, एनएससी से विभेदित न्यूरॉन्स भी सिलिअरी तस्करी assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Neurospheres neura के प्रसार से उत्पन्न होने वाले मुक्त रूप से प्रवाहित कोशिकाओं के समूहों का गठन कर रहे हैंएल स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं है कि विशिष्ट विकास कारकों और nonadhesive सतहों 43, 44 की उपस्थिति में हो जाना। Neurospheres सामान्य विकास और रोग 31, 45, 46, 47 में तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो संस्कृति मॉडल में के रूप में महत्वपूर्ण काम करते हैं। यहाँ, हम तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं संवर्धन के लिए और में न्यूरॉन्स / glia भेदभाव के लिए एक neurosphere आधारित परख का वर्णन। हम विशेष रूप से तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और विभेदित न्यूरॉन्स (चित्रा 1) के सिलिया के घटकों संकेत की तस्करी पर जोर देना। के रूप में प्राथमिक न्यूरॉन्स संवर्धन करने का विरोध किया, प्राथमिक neurospheres, संस्कृति अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं कई मार्ग के लिए उत्तरदायी होते हैं और फ्रीज-पिघलाव चक्र, और में न्यूरॉन्स / glia भेदभाव से गुजरना कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, हम चाहते हैं कि neurosphere व्युत्पन्न तंत्रिका निर्धारितस्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और विभेदित न्यूरॉन्स संस्कृति में रोमक कर रहे हैं और इन डिब्बों में सिलिअरी समारोह के लिए प्रासंगिक संकेतन अणुओं स्थानीय बनाना। Neurosphere आधारित संवर्धन तरीकों एनएससी और विभेदित न्यूरॉन्स में ciliogenesis और रोमक तस्करी के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली के रूप में काम कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम पैदा करते हैं और वयस्क माउस SVZ से neurosphere संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए एक विधि का वर्णन। संस्कृतियों के बारे में कुछ उचित अंक इस प्रकार हैं। 200 सुक्ष्ममापी – प्रथम, क्षेत्रों के आकार 50 के बीच आम तौर ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in S.M.’s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).
Materials
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24 well plate | Falcon | 353047 | |
| 4 % paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| 50 ml tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm X 10 mm X 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10×, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | PBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| FBS | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6 well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
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