בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה
Summary
Cilium העיקרי הוא גורם קריטי ב התפשטות תאים ובתאים עצבית, בידול עצבי, ואת תפקוד עצבי בוגרת. כאן, אנו מתארים שיטה ללמוד ciliogenesis וסחר איתות חלבונים כדי ריסים בתאי גזע / ובתאים עצביים נוירונים בדיל באמצעות תרבויות neurosphere עיקריות.
Abstract
The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.
Introduction
Cilium העיקרי הוא תא התת-תאי דינמי המבוסס microtubule שמתפקד אנטנה חושית בתיאום מסלולי איתות הסלולר, כולל סוניק הקיפוד (ששש) מסלול במהלך ההתפתחות העצבית עובריים 1, 2, ו איתות התת-תאי ממודרת פונקציה 3 העצבית מבוגר, 4 . איתות רכיבים של מסלולים אלה, כגון קולטן ששש טלוא 5; מסלול מפעיל smoothened (SMO) 6; ו Gpr161 7, גידול G יתום חלבון בשילוב קולטן (GPCR) כי באופן שלילי מסדיר את מסלול ששש, למקם את הריסים באופן דינמי. GPCRs המרובה דווח למקם את הריסים בנוירונים במוח 7, 8, 9, 10 </sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. פגמי ריסי מסלולי איתות שנוצר ריסים להשפיע רקמות מרובות נקראים ביחד כמו ciliopathies 17, 18, 19. הספקטרום המחלה ciliopathy קרובות כולל ליקויים נוירו-התפתחותיות, כגון הפרעות craniofacial 20, 21, 22. בנוסף, cilia העיקרי בנוירונים ההיפותלמוס לווסת מסלולי שובע מרכזיים, ופגמים לגרום להשמנה מרכזית 23, שיקוף השמנת ciliopathies syndromic כגון תסמונת Bardet Biedel 24. בנוסף, קולטן ונוירופפטידים איתות הריסים מסדיר centrשובע אל מסלולי 11, 14. לוקליזציה ריסי adenylyl cyclase III (ACIII) ו GPCRs כגון קולטן סומטוסטטין 3 ב נוירונים בהיפוקמפוס לגרום למומים זיהוי האובייקט הרומן וגירעונות זיכרון 25, 26 ו- Parallels חוסר שלמות ריסי 27. היבטים התפתחותיים של איתות שנוצר הריסים קשורות בטבורן הומאוסטזיס רקמות; בפרט, הריסים חשובים להתקדמות ומדולובלסטומות ששש-תת הנובעים אבות גרגיר של 28 המוחון, 29. לפיכך, cilia העיקרי ממלא תפקידים חשובים במהלך עוברית, לאחר הלידה, ואת ההתפתחות עצבית מבוגרת ותפקוד.
בתאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים באזור subventricular (SVZ) של החדר הלטרלי, אזור subgranular של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס, ואתאזור חדרית של החדר השלישי בהיפותלמוס ביונקים 30, 31, 32. NSCs הם מולטיפוטנטיים, בעלי יכולת התחדשות עצמית, והם חשובים להתפתחות המוח ורפואה רגנרטיבית 30. רוב NSCs ב SVZ הם שקטים ובעלי cilium העיקרי בודד כי, במקרים רבים, משתרע אל החדר לרוחב 33. אותות cilium העיקריים באמצעות הלוקליזציה של קולטנים שונים, להמרצת תגובה תאית במורד זרם, במיוחד ביחס ששש, TGFβ, ומסלולי טירוזין קינאז קולטן 2, 34, 35, 36. מאז cilia העיקרי להאריך לתוך החדר לרוחב, משערים כי cilia העיקרי לזהות ציטוקינים בנוזל השדרה (CSF) כדי להפעיל NSCs 37 </sעד>. מחקרים אחרונים מראים כי מסלול איתות ששש ו הריסים העיקריים הם קריטיים עבור הפעלת תאי גזע של תיקון והתחדשות של רקמות מרובות, כולל אפיתל ההרחה, ריאות, כליות 38, 39, 40, 41. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם CSF מתקשר עם NSCs והאם cilia העיקרי מעורבים אינם ידועים. NSCs החסיד בתרבות הוא ריסים; למקם רכיבים מסלולים ששש, כגון SMO ו Gpr161 ב ריסים; והם ששישה 42 תגובה. לפיכך, NSCs יכול לשמש כמערכת מודל חשובה ללמוד את המסלול שהשישה, סחר ריסים, ומסלולי בידול עצביים. בנוסף, נוירונים נבדלים NSCs יכולים לשמש גם עבור מבחני סחר ריסים.
Neurospheres הם היוו של צבירי תאי "פנויות" הנובעים מההפצה של neural גזע / ובתאי תאים שגדלים בנוכחות גורמי גדילה ספציפיות ומשטחי nonadhesive 43, 44. Neurospheres לשמש חשובה דגמים בתרבות במבחנה ללמוד גזע עצביים / ובתאים בפיתוח נורמלי למחלה 31, 45, 46, 47. כאן, אנו מתארים assay מבוסס-neurosphere עבור culturing גזע עצביים / ובתאים ו לבידול לתוך הנוירונים / גליה. אנחנו במיוחד להדגיש את הסחר של איתות רכיבי ריסים של גזע עצבי / ובתאים נוירונים בדיל (איור 1). בניגוד נוירונים culturing העיקרי, neurospheres העיקרי הם יחסית קל תרבות, ניתנים קטעים מרובים להקפיא להפשיר מחזורים, והוא יכול לעבור התמיינות לתוך הנוירונים / גליה. חשוב לציין, קבענו כי עצבי נגזר neurosphereתאי גזע / ובתאים נוירונים בדיל הם ריסים בתרבות LOCALIZE מולקולות איתות רלוונטיות לתפקוד ריסים בתאים אלה. Neurosphere מבוסס שיטות culturing יכולות לשמש כמערכת מודל אידיאלית ללימוד סחר ciliogenesis ואת הריסים ב NSCs נוירונים בדיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים שיטה להפקה ולשמור תרבויות neurosphere מן SVZ עכבר המבוגר. כמה נקודות רלוונטיות לגבי התרבויות הן כדלקמן. ראשית, בגדלים של הספירות הם בדרך כלל בין 50 ל – 200 מיקרומטר. מניסיוננו, כאשר neurosphere מקבל גדול יותר 300 מיקרומטר קוטר, הזמן האופטימלי עבור passaging הוחמץ. תחומים גדו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in S.M.’s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).
Materials
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24 well plate | Falcon | 353047 | |
| 4 % paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| 50 ml tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm X 10 mm X 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10×, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | PBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| FBS | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6 well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
Referências
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
- Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
- Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
- Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
- Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
- Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
- Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
- Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
- Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
- Hildebrandt, F. .. ,. ,. T. .. ,. &. a. m. p. ;. K. a. t. s. a. n. i. s. ,. N. .., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
- Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
- Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
- Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G. Primary cilia in neurodevelopmental disorders. Nat Rev Neurol. 10, 27-36 (2014).
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
- Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
- Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
- Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
- Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
- Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
- Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
- Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
- Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
- Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
- Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
- Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
- Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
- Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
- Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
- Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
- Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
- Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).
