Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie
Summary
Während die Infiltrierung von Makrophagen kontinuierlich zu erwachsenen Geweben aus zirkulierenden Vorläufern rekrutiert wird, säen sich residente Makrophagen ihr Gewebe während der Entwicklung, wo sie ohne weitere Eingaben von Vorläufern aufrechterhalten werden. Die Vorläufer für Resident-Makrophagen wurden vor kurzem identifiziert. Hier stellen wir Methoden für die genetische Schicksalskartierung der residenten Makrophagen-Vorläufer vor.
Abstract
Makrophagen sind professionelle Phagozyten aus dem angeborenen Arm des Immunsystems. Im stationären Zustand werden sessile Makrophagen in erwachsenen Geweben gefunden, wo sie als Frontline-Sentinels der Infektion und Gewebeschädigung wirken. Während andere Immunzellen kontinuierlich von hämatopoetischen Stammzellen und Progenitorzellen (HSPC), die sich im Knochenmark befinden, erneuert werden, wurde gezeigt, dass eine Reihe von Makrophagen, die als Resident-Makrophagen bekannt sind, in Geweben ohne Input von Knochenmark-HSPCs selbstgehalten werden. Diese Linie wird durch Mikroglia im Gehirn, Kupffer Zellen in der Leber und Langerhans Zellen in der Epidermis unter anderem veranschaulicht. Die Darm- und Colon-Lamina-Propria sind die einzigen erwachsenen Gewebe ohne HSPC-unabhängige Resident-Makrophagen. Neuere Untersuchungen haben festgestellt, dass residente Makrophagen aus der extra-embryonalen Dottersack-Hämatopoese von Progenitor (en) stammen, die sich von fetalen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) unterscheiden. Unter Dottersack endgültige Hämatopoese, eRythromyeloid-Vorläufer (EMP) ergeben sowohl erythroide als auch myeloide Zellen, insbesondere residente Makrophagen. EMP werden nur innerhalb des Dottersackes zwischen E8.5 und E10.5 Tagen der Entwicklung erzeugt und sie wandern in die fetale Leber, sobald die Zirkulation verbunden ist, wo sie sich erweitern und differenzieren bis mindestens E16.5. Ihre Nachkommenschaft umfasst Erythrozyten, Makrophagen, Neutrophilen und Mastzellen, aber nur EMP-abgeleitete Makrophagen bestehen bis zum Erwachsenenalter in Geweben. Die vorübergehende Natur von EMP-Emergenz und die zeitliche Überlappung mit HSC-Generation macht die Analyse dieser Vorläufer schwierig. Wir haben ein Tamoxifen-induzierbares Schicksal-Mapping-Protokoll auf der Grundlage der Expression des Makrophagen-Cytokin-Rezeptor-Csf1r-Promotors zur Charakterisierung von EMP- und EMP-abgeleiteten Zellen in vivo durch Durchflusszytometrie etabliert.
Introduction
Es gibt mehrere aufeinanderfolgende, aber überlappende Wellen von hämatopoetischen Vorläufern während der Entwicklung, deren myeloide Nachkommen im Erwachsenenalter bleiben. Zuerst treten in der Maus-Dottersack 1 , 2 zwischen E7.5-E8.25 unipotent "primitive" Vorläufer auf und geben embryonale Makrophagen ohne monozytische Zwischenstufe hervor. Ob Makrophagen aus primitiven Vorläufern im erwachsenen Gehirn bestehen, da die Mikroglia ein Gegenstand der aktiven Untersuchung bleibt. Zweitens entstehen Erythro-Myeloid-Vorläufer (EMPs) im Eigelb-Sack bei E8.5, treten in den Blutkreislauf ein und kolonisieren den Embryo. EMPs entstehen aus dem hämogenen Endothel des Dottersackes in einem Runx1-abhängigen endothelial-zu-hämatopoetischen Übergang 3 , 4 . Während EMP in Makrophagen im Dottersack differenzieren kann, kolonisieren sie auch die fetale Leber vom embryonalen Tag (E) 9 5 und unterscheiden sichIn Erythrozyten, Megakaryozyten, Makrophagen, Monozyten Granulozyten und Mastzellen eindringen 6 . Die Makrophagen, die sich aus EMPs ergeben, zeigen proliferative Kapazitäten in Entwicklungs- und Erwachsenengeweben. Ob EMP-abgeleitete Makrophagen die Monozytenstadien der Differenzierung umgehen, ist noch umstritten, da sehr wenig über ihren Differenzierungsweg 7 , 8 bekannt ist . Schließlich treten Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) bei E10.5 innerhalb des Embryos aus der Aorta-Gonaden-Mesonephros-Region auf und wandern in die fetale Leber. HSCs mit Langzeit-Wiederauffüllungsvermögen werden erst nach E11 (bei der 42 Somite-Pair-Stufe) erkannt 9 . Dort erweitern und unterscheiden sie sich von E12.5 bis die endgültige Hämatopoese beginnt, sich auf das Knochenmark zu verlagern, das die vorherrschende Stelle der Blutzellproduktion für die Dauer des postnatalen Lebens wird 10 .
Die spAtiale und zeitliche Überlappung beim Auftauchen sowie gemeinsame immuno-phänotypische Marker hat damit unsere Fähigkeit, die spezifischen Beiträge dieser Wellen von embryonalen hämatopoetischen Vorläufern zu unterscheiden, behindert. Während sowohl EMP als auch HSC in einer Runx1-abhängigen Weise erzeugt werden und der Transkriptionsfaktor Myb und der Wachstumsfaktor-Rezeptor Csf1r (Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, auch bekannt als Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor-Rezeptor) genannt werden, können sich EMPs unterscheiden HSCs durch ihren Mangel an lymphoiden Potenzialen, sowohl in vitro als auch in vivo , ihr Mangel an langfristigem Rezyklierungspotential und mangelnde Oberflächenexpression des Linienmarkers Sca-1 11 . Genetische Schicksal-Mapping-Modelle sind erforderlich, um Makrophagen-Ontogenese zu charakterisieren, da sie die Ausrichtung embryonaler Progenitoren in einer zellspezifischen und zeitspezifischen Weise ermöglichen. Hier stellen wir das Schicksal-Mapping-Protokoll vor, das in unserem Labor verwendet wird, um zwischen den beiden Linien zu unterscheidenS von Makrophagen, die in den meisten erwachsenen Geweben gefunden wurden: HSC-abgeleitete infiltrierende Makrophagen und HSC-unabhängige Resident-Makrophagen.
Gewebe-residente Makrophagen wurden auf Myb-unabhängige Vorläuferzellen zurückgeführt, die den Cytokinrezeptor Csf1r 12 exprimieren und im Embryo bei E8.5-E10.5 unter Verwendung von drei komplementären Fate-Mapping-Strategien vorhanden sind 6 . Um die Dottersack-Hämatopoese ohne Etikettierung von fetalen HSCs zu untersuchen, verwenden wir einen transgenen Stamm, Csf1r MeriCreMer , der ein Tamoxifen-induzierbares Fusionsprotein von 'verbesserter' Cre-Rekombinase und zwei Maus-Östrogen-Rezeptoren (Mer-iCre-Mer) unter der Kontrolle von Der Csf1r-Promotor. Daher wird die Cre-Rekombinase in Csf1r- exprimierenden Zellen während eines begrenzten Zeitfensters aktiv sein. Bei Verwendung eines Reporterstamms, der ein fluoreszierendes Protein stromabwärts einer lox-STOP-lox-Kassette (Rosa26 LSL-eYFP ) enthält, führt es zu einem bleibendenEnt genetische Markierung der zur Zeit der Induktion vorhandenen Zellen, aber auch ihrer Nachkommenschaft. Die Verabreichung von E8.5 der aktiven Form von Tamoxifen, 4-Hydroxytamoxifen (OH-TAM), Etiketten EMPs und Makrophagen, ohne Etikettierung von Dottersack-Unipotenten "primitiven" Vorläufern oder fetalen HSCs. Dabei haben wir den Immunphänotyp von EMPs und ihre Nachkommen bei der embryonalen Entwicklung charakterisiert und den Beitrag von Dottersack-abgeleiteten Makrophagen zu den erwachsenen Makrophagen-Pools beurteilt. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um zu charakterisieren, ob primitive Progenitor-abgeleitete Makrophagen auch mit diesem Ansatz markiert werden und ob sie zu erwachsenen Makrophagenpools beitragen können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die verschiedenen Wellen der hämatopoetischen Vorläuferzellen überlappen sich teilweise innerhalb eines kurzen Zeitrahmens, was die Analyse des Beitrags jeder Welle der Entwicklungshämatopoese zu den Immunzellen technisch sehr anspruchsvoll macht.
Tamoxifen-induzierbare Cre-Systeme bieten die Möglichkeit, spezifische Zellen zeitlich induzierbar zu markieren und eine Abstammungsanalyse bei Embryonen oder Erwachsenen durchzuführen, ohne die Ex-vivo- oder In-vitro- Kultu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Prof. Frederic Geissmann und Prof. Christian Schulz für aufschlussreiche Diskussionen; Dr. Hannah Garner für kritische Lektüre des Manuskripts, Dr. Xavier Montagutelli und Dr. Jean Jaubert und die Mitarbeiter des Institut Pasteur Tieres zur Unterstützung bei der Maushaltung; Und Pascal Dardenne und Vytaute Boreikaite, ein Amgen Scholar, für ihre technische Unterstützung. Die Forschung im EGP-Labor wird vom Institut Pasteur, dem CNRS, dem Cercle FSER (FRM und einem Startpaket vom Institut Pasteur und dem REVIVE-Konsortium) gefördert. LI wird von einem Promotionsstipendium des REVIVE-Konsortiums unterstützt.
Materials
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
Referências
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