Identifikation af erythromyeloidprogenitorer og deres afkom i musembryoen ved flowcytometri
Summary
Selv om infiltrerende makrofager rekrutteres kontinuerligt til voksne væv fra cirkulerende forstadier, frøer residente makrofager deres væv under udvikling, hvor de opretholdes uden yderligere indløb fra forfædre. Forfædrene for residente makrofager blev for nylig identificeret. Her præsenterer vi metoder til den genetiske skæbneplanlægning af de residente makrofagprogenitorer.
Abstract
Makrofager er faglige fagocytter fra den medfødte arm af immunsystemet. I steady-state findes sessile makrofager i voksne væv, hvor de fungerer som frontlinjesangivelser af infektion og vævsskade. Mens andre immunceller kontinuerligt fornyes fra hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC), der er placeret i knoglemarven, har en række makrofager, der er kendt som residente makrofager, vist sig selvforsynet i væv uden input fra knoglemarvs HSPC'er. Denne slægt er eksemplificeret ved microglia i hjernen, Kupffer celler i leveren og Langerhans celler i epidermis blandt andre. Tarm- og colon lamina propria er de eneste voksne væv uden HSPC-uafhængige bosiddende makrofager. Nylige undersøgelser har identificeret, at hjemmehørende makrofager stammer fra den ekstra-embryonale æggeblomme-hæmatopoiesis fra stamceller, der er forskellige fra føtal hæmatopoietiske stamceller (HSC). Blandt æggeblomme sac definitiv hæmatopoiesis, eRythromyeloid progenitorer (EMP) giver anledning til både erythroid og myeloidceller, især residente makrofager. EMP genereres kun i æggeblomme sac mellem E8.5 og E10.5 udviklingsdage, og de migrerer til føtalelever så tidligt som omsætning er forbundet, hvor de udvides og differentieres til mindst E16.5. Deres afkom omfatter erythrocytter, makrofager, neutrofiler og mastceller, men kun EMP-afledte makrofager fortsætter indtil voksenalderen i væv. Den forbigående karakter af EMP-fremkomsten og den tidsmæssige overlapning med HSC-generering gør analysen af disse forgængere vanskelig. Vi har etableret en tamoxifen-inducerbar skæbneplanlægningsprotokol baseret på ekspression af makrofag-cytokinreceptor Csf1r-promotoren til karakterisering af EMP- og EMP-afledte celler in vivo ved flowcytometri.
Introduction
Der er flere på hinanden følgende men overlappende bølger af hæmatopoietiske stamceller under udvikling, hvis myeloid afkom forbliver i voksenalderen. For det første kommer unipotente "primitive" forfædre frem i muskelblomme sac 1 , 2 mellem E7.5-E8.25 og give anledning til embryonale makrofager uden noget monocytisk mellemprodukt. Hvorvidt makrofager afledt af primitive stamceller fortsætter i den voksne hjerne, da microglia fortsat er et emne for aktiv undersøgelse. For det andet opstår Erythro-Myeloid Precursors (EMP'er) i æggeblomme Sac ved E8.5, indtræder blodbanen og koloniserer embryoet. EMP'er kommer frem fra æggeblomme sac hæmogent endotel i en Runx1-afhængig endotel-til-hæmatopoietisk overgang 3 , 4 . Mens EMP kan differentiere i makrofager inden for æggeblommehalsen, koloniserer de også føtalelever fra embryonal dag (E) 9 5 og adskiller sigTia i erythrocytter, megakaryocytter, makrofager, monocytter granulocytter og mastceller 6 . De makrofager, der stammer fra EMP'er, udviser proliferativ kapacitet i udviklings- og voksenvæv. Hvorvidt EMP-afledte makrofager omgår monocytfasen af differentiering er stadig kontroversiel, da meget lidt er kendt om deres differentieringsvej 7 , 8 . Endelig kommer hæmatopoietiske stamceller (HSCs) frem til E10.5 inden for det egentlige embryo fra aorta-gonad-mesonephros-regionen og migrere til føtalelever. HSC'er med langvarig repopulationskapacitet registreres kun efter E11 (ved 42-somite-par-scenen) 9 . Der udvider og differentieres de fra E12.5, indtil definitiv hæmatopoiesis begynder at skifte til knoglemarv, som bliver det overvejende sted for blodcelleproduktion i postnatalt liv 10 .
SpAtiel og tidsmæssig overlapning i fremkomsten såvel som delte immunfænotypiske markører har hidtil hæmmet vores evne til at skelne de specifikke bidrag fra disse bølger af embryonale hæmatopoietiske stamceller. Mens både EMP og HSC genereres på en Runx1-afhængig måde og udtrykker transkriptionsfaktoren Myb og vækstfaktorreceptoren Csf1r (kolonistimulerende faktor 1-receptor, også kendt som makrofagkoloniestimulerende faktorreceptor) blandt andre, kan EMP'er skelnes fra HSCs ved deres mangel på lymfoide potentiale, både in vitro og in vivo , deres mangel på langsigtet repopuleringspotentiale og mangel på overfladekspression af linjemarkøren Sca- 11 . Genetiske skæbne kortlægningsmodeller er nødvendige for at karakterisere makrofag ontogeni, da de tillader målretning af embryonale forfædre på en celle-specifik og tidsspecifik måde. Her præsenterer vi skæbne-kortlægningsprotokollen anvendt i vores laboratorium for at diskriminere mellem de to linjerS af makrofager fundet i de fleste voksne væv: HSC-afledte infiltrerende makrofager og HSC-uafhængige residente makrofager.
Tissue stationære makrofager er blevet sporet tilbage til Myb-uafhængige precursorceller udtrykker cytokinreceptor Csf1r 12 og er til stede i embryoet på E8.5-E10.5 anvendelse af tre komplementære skæbne-kortlægningsstrategier 6. For at studere æggeblomme sac hæmatopoiesis uden mærkning af føtal HSCs bruger vi en transgen stamme, Csf1r MeriCreMer , der udtrykker et tamoxifen-inducerbart fusionsprotein af "forbedret" Cre recombinase og to musestrogenreceptorer (Mer-iCre-Mer) under kontrol af Csf1r-promotoren. Derfor vil Cre recombinasen være aktiv i Csf1r-ekspresserende celler under et begrænset tidsvindue. Når det anvendes med en reporterstamme indeholdende et fluorescerende protein nedstrøms for en lox-STOP-lox-kassette (Rosa26 LSL-eYFP ), vil det føre til permanentEnt genetiske mærkning af cellerne til stede på tidspunktet for induktion men også af deres afkom. Administration ved E8.5 af aktiv form af tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), EMP'er og makrofager uden mærkning af æggeblomme sac unipotente "primitive" forfædre eller føtal HSCs. Dermed har vi karakteriseret immunophenotypen af EMP'er og deres afkom under embryonisk udvikling samt vurderet bidraget af æggeblomme-sac-afledte makrofager til de voksne makrofagpuljer. Yderligere arbejde er nødvendigt for at karakterisere, om primitive stamcellerafledte makrofager også mærkes med denne tilgang og om de kan bidrage til voksne makrofagpuljer.
Protocol
Representative Results
Discussion
De forskellige bølger af hæmatopoietiske precursorceller overlapper delvist inden for en kort tidsramme, hvilket gør analysen af bidraget fra hver bølge af udviklingshematopoiesis til immunceller teknisk teknisk udfordrende.
Tamoxifen-inducerbare Cre-systemer giver mulighed for at mærke specifikke celler på en temporær inducerbar måde og udføre linieanalyse i embryoner eller voksne uden behov for ex vivo eller in vitro- kultur eller transplantation. I tamoxif…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Prof Frederic Geissmann og Prof Christian Schulz for indgående drøftelser; Dr Hannah Garner for kritisk læsning af manuskriptet, dr. Xavier Montagutelli og dr. Jean Jaubert og personalet på Institut Pasteur dyreanlæg til støtte med musemestring; Og Pascal Dardenne og Vytaute Boreikaite, en Amgen Scholar, til deres tekniske bistand. Forskning i EGP-laboratoriet finansieres af Institut Pasteur, CNRS, Cercle FSER (FRM og en startpakke fra Institut Pasteur og REVIVE-konsortiet. LI støttes af et ph.d.-stipendium fra REVIVE-konsortiet.
Materials
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
Referências
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero, ., E, , et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
